改良Feulgen 染色法檢測(cè)標(biāo)本細(xì)胞DNA 的效果評(píng)估

鄭 濤，陳偉芳，張夢(mèng)琦，韓永良，魏淑飛

宮頸癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，已成為威脅女性健康的第二大殺手，宮頸癌的早期診斷，早期治療是提高患者生活質(zhì)量的有效手段。 隨著分子病理檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA 倍體分析廣泛應(yīng)用，為癌癥的早期診斷和篩查提供了重要的檢測(cè)途徑。

Feulgen 染色法是DNA 染色的標(biāo)準(zhǔn)染色方法，其原理在于通過(guò)酸水解使DNA 中嘌呤脫氧糖苷鍵打開(kāi)，暴露出醛基，然后通過(guò)Feulgen 液顯色［1，2］，從而達(dá)到檢測(cè)標(biāo)本中細(xì)胞DNA 的變化情況。 經(jīng)典Feulgen 染色法操作時(shí)間較長(zhǎng)，需要長(zhǎng)達(dá)4 h，經(jīng)過(guò)不斷實(shí)驗(yàn)摸索和反復(fù)改進(jìn)， 筆者探索出一種改良Feulgen 染色法，并與經(jīng)典Feulgen 染色法進(jìn)行了比較。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及分組收集九江學(xué)院附屬醫(yī)院婦科門診2018 年12 月1 日—12 月20 日進(jìn)行宮頸癌普查檢測(cè)所取標(biāo)本300 例，每例標(biāo)本進(jìn)行液基制片各3 份，隨機(jī)分為標(biāo)準(zhǔn)組，實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)驗(yàn)組2，分別進(jìn)行染色。 每批每組染色時(shí)均放入標(biāo)準(zhǔn)干片同時(shí)染色，進(jìn)行質(zhì)控。標(biāo)準(zhǔn)組是按4 h 流程的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)程序染色， 實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2 均是按30 min 的改良Feulgen 法染色。

標(biāo)準(zhǔn)片30 例，由麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司提供，隨機(jī)分成標(biāo)準(zhǔn)組，實(shí)驗(yàn)組1，實(shí)驗(yàn)組2，標(biāo)準(zhǔn)組采用傳統(tǒng)Feulgen 染色法， 實(shí)驗(yàn)組1 及實(shí)驗(yàn)組2 采用改良Feulgen 染色法。

1.2 試劑與儀器固定液：使用甲醇、福爾馬林和冰醋酸（85/10/5%v/v）的混合液（即BS 固定液）進(jìn)行固定；5N 鹽酸：濃鹽酸與蒸餾水以42：58（v/v）比例混合。 DNA 染液（由廈門邁克奧迪公司提供）與5N鹽酸及蒸餾水按比例配置，攪拌60～90 min 后使用。

儀器：Motic DNA 圖像分析系統(tǒng) （麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）SHP-250FE 智能生化培養(yǎng)箱 （上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 經(jīng)典Feulgen 染色法 標(biāo)準(zhǔn)組步驟： 按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3.2 改良Feulgen 染色法 （1）B.S 固定液中固定5 min（水浴50 ℃）；（2）流水洗滌4～5 次；（3）5N 鹽酸酸解6 min （水浴50 ℃）；（4） 流水洗滌4～5 次；（5）將切片置染液中染色7 min（25±2 ℃）；（6）流水洗滌4～5 次后，水中繼續(xù)浸洗15 min；（7）脫水：置50%—75%－100%－100%—100%乙醇中逐級(jí)脫水，各1 min；（8）濕式封片：切片迅速依次轉(zhuǎn)入無(wú)水乙醇∶二甲苯 （1∶1）—100%二甲苯—100%二甲苯，各1～3 min； 最后一張一張取出， 滴加中性樹(shù)膠封片；（9）進(jìn)行掃描及圖像分析。

另取標(biāo)準(zhǔn)片分別用兩種方法進(jìn)行染色，分析新方法的重復(fù)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，組間差異按方差分析進(jìn)行t 檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種方法染色圖像分析檢測(cè)鏡下效果細(xì)胞輪廓清楚，核染色深，背景干凈。 見(jiàn)圖1。

圖1 染色圖像分析檢測(cè)結(jié)果

2.2 兩種染色法對(duì)宮頸標(biāo)本二倍體細(xì)胞核IOD、DI、CV 值一致性的影響經(jīng)麥克奧迪實(shí)業(yè)有限公司提供的Moticymeter 掃描后Classify 分析系統(tǒng)分析，各組常規(guī)標(biāo)本（除微生物感染標(biāo)本）各組染色直方圖及散點(diǎn)圖（圖2），實(shí)驗(yàn)組宮頸標(biāo)本二倍體細(xì)胞核IOD、DI、CV 值與標(biāo)準(zhǔn)組對(duì)比（P＞0.1），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 按此標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各實(shí)驗(yàn)組染色質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)組進(jìn)行比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

2.3 兩種染色法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)片細(xì)胞核IOD、DI、CV 值一致性的影響傳統(tǒng)方法染色細(xì)胞核IOD 平均值為112.4，實(shí)驗(yàn)組分別為110.7 及108.2，與標(biāo)準(zhǔn)組對(duì)比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.1）（表2），表明此改良方法重復(fù)性高，穩(wěn)定性好。

3 討 論

隨著分子病理的研究不斷深入，分子水平的研究結(jié)果引起了眾多學(xué)者的關(guān)注， 目前Feulgen 染色仍然為DNA 圖像分析系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)染色方法， 其機(jī)制是細(xì)胞DNA 中脫氧核糖與嘌呤之間的糖苷鍵經(jīng)鹽酸水解后斷裂，脫氧核糖一端離醛暴露，并且與染色液中硫堇和亞硫酸根的中間產(chǎn)物相互作用形成藍(lán)紫色化合物。 改良Feulgen 染色法是采用硫堇試劑冷配法、高濃度鹽酸高溫下一步水解法，結(jié)果呈藍(lán)色，使DNA 染色效果達(dá)到了檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，克服了經(jīng)典Feulgen 染色時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4 h 的缺點(diǎn)，縮短到30 min，大大提高了工作效率，并借此可以拓展細(xì)胞DNA 檢測(cè)的應(yīng)用范圍。

圖2 同一標(biāo)本各組染色直方圖及散點(diǎn)圖對(duì)比

表1 兩種染色方法宮頸標(biāo)本二倍體細(xì)胞核IOD、DI、CV 值的情況

表2 兩種染色方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)片細(xì)胞核IOD、DI、CV 值的情況

在印片、冷凍切片、石蠟切片及液基制片中細(xì)胞DNA 染色中， 對(duì)經(jīng)典Feulgen 染色技術(shù)進(jìn)行改良，在國(guó)內(nèi)外均為有一定的嘗試和報(bào)道［4，5］，該文應(yīng)用改良Feulgen 染色法進(jìn)行宮頸癌普查檢測(cè)樣本液基細(xì)胞進(jìn)行染色，獲得了與傳統(tǒng)方法相同且滿意的結(jié)果，細(xì)胞核染色深，結(jié)構(gòu)清晰，背景著色淡，而所需染色時(shí)間則大大縮短，每批標(biāo)本染色總共所耗的時(shí)間由常規(guī)染色的4 h 縮短到30 min； 圖像分析檢測(cè)顯示，應(yīng)用改良Feulgen 方法染色結(jié)果，與傳統(tǒng)方法結(jié)果基本相符，而且有較好的重復(fù)性。

DNA 染色的成敗關(guān)鍵在于酸解，酸解不充分將致Feulgen 反應(yīng)減弱，過(guò)度則呈陰性結(jié)果，而酸解時(shí)間與溫度對(duì)其結(jié)果影響為最大［6］。 該文采用了升溫酸解的方法，不僅確保了酸解的穩(wěn)定性，而且還避免了長(zhǎng)時(shí)間固定和酸解造成制片脫落的不良現(xiàn)象，在染色過(guò)程中，應(yīng)該嚴(yán)格把握酸解時(shí)間［7］。在常規(guī)脫落細(xì)胞學(xué)單憑細(xì)胞形態(tài)判斷良惡性遇到困難時(shí)，細(xì)胞DNA 倍體分析可提供重要參考數(shù)據(jù)， 經(jīng)典Feulgen 染色法耗時(shí)長(zhǎng)， 改良Feulgen 染色法的應(yīng)用，大大縮短了染色時(shí)間，且效果穩(wěn)定，滿足了快速診斷的要求。筆者認(rèn)為，改良Feulgen 染色法與經(jīng)典Feulgen 染色法對(duì)檢測(cè)細(xì)胞DNA 結(jié)果高度一致，將改良Feulgen 染色法檢測(cè)DNA 含量分析方法在臨床疾病的輔助診斷，時(shí)間短、穩(wěn)定性好，提高了工作效率，值得應(yīng)用與推廣。