顱腦損傷誘導(dǎo)聯(lián)合應(yīng)用他克莫司促進周圍神經(jīng)再生實驗研究*

何新澤，楊 濤，林書卿，李 芹，王成剛，高麗麗，于立志，孫金占，王 培

1.山東省濱州市中心醫(yī)院(濱州251700)；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院手足外科(承德067000)

顱腦損傷合并周圍神經(jīng)損傷并不罕見，神經(jīng)損傷后的恢復(fù)具有特殊性，功能恢復(fù)不全，致殘率較高[1-6]。Wang、何新澤等研究發(fā)現(xiàn)，實驗大鼠在顱腦損傷后合并周圍神經(jīng)損傷，損傷坐骨神經(jīng)的修復(fù)速度加快，但修復(fù)機制尚不清楚[2-8]。研究發(fā)現(xiàn)他克莫司可促進損傷神經(jīng)修復(fù)再生[3-14]。大量的實驗發(fā)現(xiàn)，他克莫司促進周圍神經(jīng)損傷后的再生，主要通過免疫抑制、神經(jīng)營養(yǎng)來實現(xiàn)[15-24]。本實驗擬通過他克莫司促進神經(jīng)損傷恢復(fù)機制，探索顱腦損傷促進神經(jīng)損傷恢復(fù)的機制。

材料和方法

1 造模動物及材料 實驗在2018年10月至2019年2月在濱州市中心醫(yī)院完成。

1.1 實驗動物：選用SPF級雄性SD大鼠180只，200～220 g[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK (京) 2012-0001]。飼養(yǎng)在晝夜各12 h節(jié)律下，實驗室溫度維持在(23±1)℃。將大鼠完全隨機分為四組，每組45只。實驗經(jīng)過濱州市中心醫(yī)院倫理委員會批準，按照國際動物實驗標(biāo)準執(zhí)行。

1.2 主要設(shè)備及試劑：手術(shù)顯微鏡(LZL-6A型，鎮(zhèn)江中天公司)，光學(xué)顯微鏡(BH-3型，Olympus公司)，電子分析天平(ESJ200-4 ±0.0001g)，他克莫司(Tacrolimus)100mg(Selleck)，Masson三色染色試劑盒(標(biāo)準型，江蘇Key GEN生物)，Peroxidase來源于辣根100mg(Sigma)。

2 研究方法

2.1 造模：禁食水4 h，術(shù)前30 min，肌肉注射頭孢唑啉鈉10 mg/100g預(yù)防感染，術(shù)區(qū)備皮剪毛。10%水合氯醛按照0.35 ml/100g進行腹腔全麻。A組(顱腦損傷+坐骨神經(jīng)損傷)：消毒，沿頭部正中矢狀切開，在顱骨冠狀線后1.5 mm、中線偏左5 mm處開直徑5 mm骨窗，撞擊造成中度腦損傷；右側(cè)臀部，顯微鏡下完全切斷坐骨神經(jīng)，9-0無損傷線縫合坐骨神經(jīng)外膜4～6針[11]。B組 (坐骨神經(jīng)損傷)：SD大鼠僅于顯微鏡下完全切斷右側(cè)坐骨神經(jīng)，縫合坐骨神經(jīng)外膜。

2.2 造模后的干預(yù)：分籠飼養(yǎng)在同樣環(huán)境中。他克莫司用0.9%氯化鈉稀釋，1 ml 0.9%氯化鈉+1 mg他克莫司，現(xiàn)用現(xiàn)配制，4℃恒溫保存；造模手術(shù)12 h后，A1組SD大鼠給予他克莫司按1 mg/200 mg腹腔注射，A2組給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射，B1組大鼠給予他克莫司按1 mg/200 mg腹腔注射，B2組大鼠給予生理鹽水按1 ml/200 mg腹腔注射。每日應(yīng)用1次，連續(xù)2周。SD大鼠均存活。

3 觀察指標(biāo)

3.1 坐骨神經(jīng)指數(shù)(Sciatic nerve function index，SFI)的測量：分別于造模后4、8、12周，每組每次隨機取10只大鼠。根據(jù)Schiaveto de Souza A方法[8]，實驗側(cè)足3個參數(shù)分別為：實驗側(cè)足印長度(SPL)、實驗側(cè)足趾寬度(STS)、實驗側(cè)中間足趾距離(SIT)；正常側(cè)足3個參數(shù)分別為正常側(cè)足印長度(ZPL)、正常側(cè)足趾寬度(ZTS)、正常側(cè)中間足趾距離(ZIT)。

3.2 腓腸肌恢復(fù)率:造模手術(shù)4周、8周、12周，每組隨機取5只大鼠，取下完整的雙側(cè)腓腸肌，吸取肌肉周圍的血液，雙側(cè)腓腸肌在分析天平上稱重。計算腓腸肌的恢復(fù)率，推測運動功能恢復(fù)的情況。

3.3 神經(jīng)Masson染色：第4周、第8周、第12周，隨機取5只大鼠，切取吻合口遠、近端0.5 cm坐骨神經(jīng)，10%甲醛固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度5 μm，染色、封片，光學(xué)顯微鏡下觀察神經(jīng)纖維、膠原纖維增生情況。

3.4 辣根過氧化物酶(HRP)示蹤：分別于造模術(shù)后第8周、第12周，于坐骨神經(jīng)斷端以遠0.5 cm處，注入30%HRP溶液5 μl。深麻醉下開胸，灌流固定，取坐骨神經(jīng)相應(yīng)脊髓節(jié)段，橫斷面連續(xù)振蕩切片30 μm。光鏡下觀察脊髓前角運動神經(jīng)元中被標(biāo)記為藍染顆粒的胞體數(shù)目。

4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件，組間均數(shù)比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料間接化法計算率，進行統(tǒng)計分析，以P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 造模后大鼠基本生活狀態(tài) 造模后所有動物均存活，未發(fā)現(xiàn)切口感染情況。造模手術(shù)后5 d B2組SD大鼠出現(xiàn)足部紅腫明顯，其他組紅腫較輕。3周后，A2、B1、B2組SD大鼠足跟出現(xiàn)程度不同的潰瘍面，A1組SD大鼠足部未見明顯潰瘍；12周時，各組SD大鼠足部潰瘍基本痊愈，B2組SD大鼠出現(xiàn)足部的自食現(xiàn)象。

2 大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI) 暗箱測試結(jié)果顯示，造模后第4周，A1組與A2組、B1組與B2組SD大鼠的坐骨神經(jīng)功能指數(shù)接近(P>0.05)，A1組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)優(yōu)于B1組、B2組，A2組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)優(yōu)于B1、B2組(P<0.01)；第4周后大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)逐漸降低，第8、12周時，A2組與B1組大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)接近(P>0.05)，A1組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)優(yōu)于A2、B1、B2組大鼠，A2組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)優(yōu)于B2組，B1組坐骨神經(jīng)功能指數(shù)優(yōu)于B2組(P<0.01)。見表1。

表1 腦損傷、他克莫司對周圍神經(jīng)損傷大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)的影響

3 腓腸肌恢復(fù)率 4周后取材可見各組大鼠失神經(jīng)支配的腓腸肌顏色均較健側(cè)蒼白，肌肉明顯萎縮，8周、12周后A1組、A2組、B1組大鼠神經(jīng)損傷側(cè)腓腸肌恢復(fù)明顯優(yōu)于B2組。4周后，A2組大鼠腓腸肌恢復(fù)率與B1組、B2組大鼠腓腸肌恢復(fù)率、B1組大鼠腓腸肌恢復(fù)率與B2組大鼠腓腸肌恢復(fù)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，A1組大鼠腓腸肌恢復(fù)率優(yōu)于A2組、B1組、B2組大鼠腓腸肌恢復(fù)率(P<0.01)；4周后四組大鼠出現(xiàn)腓腸肌恢復(fù)率升高，第8、12周時，A1組與A2組大鼠腓腸肌恢復(fù)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，A1組大鼠的腓腸肌恢復(fù)率優(yōu)于B1組、B2組、A2組、B1組大鼠的腓腸肌恢復(fù)率優(yōu)于B2組大鼠腓腸肌恢復(fù)率(P<0.01)；術(shù)后8周A2組大鼠腓腸肌恢復(fù)率優(yōu)于B1組大鼠腓腸肌恢復(fù)率(P<0.01)；術(shù)后12周A2組與B1組大鼠腓腸肌恢復(fù)率比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.01，圖1)。

4 神經(jīng)Masson三色法染色 造模4周后A1組、B1組神經(jīng)纖維紅染較多，綠色纖維較少，A2組綠染與紅染均勻，B2組未見紅染的神經(jīng)纖維；造模8周后A1組、A2組、B1組可見綠染與紅染均勻分布，B2組可見再生的軸突；造模12周后A1組膠原纖維均勻分布，并呈波浪形隨神經(jīng)纖維排列，A2組、B1組可見綠染與紅染分布均勻，B2組可見大量膠原纖維，少量再生的軸突(圖2)。

圖1 腦損傷、他克莫司對周圍神經(jīng)損傷大鼠

圖2 坐骨神經(jīng)Masson三色染色(×400)

圖3 辣根過氧化物酶(HPR)聯(lián)苯胺染色(×400)

5 神經(jīng)元HRP標(biāo)記 光鏡下，觀察到相應(yīng)脊髓節(jié)段的前角神經(jīng)元細胞胞漿中發(fā)現(xiàn)標(biāo)記成藍黑色的HRP陽性顆粒細胞(圖3)。每高倍視野下進行計數(shù)，統(tǒng)計分析結(jié)果；造模后第8周，各組脊髓神經(jīng)元胞漿HRP標(biāo)記陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，A1組脊髓前角陽性標(biāo)記率高于A2組、B1組、B2組，A2組HRP標(biāo)記細胞陽性率高于B1組、B2組，B1組HRP標(biāo)記陽性率高于B2組；第12周時，A2組HRP標(biāo)記脊髓前角陽性率與B1組大鼠脊髓神經(jīng)元胞漿HRP標(biāo)記陽性率接近(P>0.01)，A1組HRP標(biāo)記脊髓前角陽性率高于A2組、B1組、B2組，A2組HRP標(biāo)記脊髓前角陽性率高于B2組，B1組HRP標(biāo)記陽性率高于B2組(P<0.01)(圖4)。

圖4腦損傷、他克莫司對周圍神經(jīng)損傷大鼠脊髓神經(jīng)元HRP標(biāo)記陽性率(%)的影響(神經(jīng)元胞漿中均發(fā)現(xiàn)標(biāo)記成藍黑色的HRP陽性顆粒)

討 論

何新澤等動物實驗發(fā)現(xiàn)大鼠腦損傷后損傷的坐骨神經(jīng)的修復(fù)重建有明顯促進作用，但具體修復(fù)機制尚不清楚[25-29]。本文通過動物實驗比較顱腦損傷聯(lián)合應(yīng)用他克莫司的坐骨神經(jīng)損傷大鼠，損傷后的坐骨神經(jīng)損傷恢復(fù)的情況。在所有的實驗觀測項目中，顱腦損傷聯(lián)合他克莫司(A1)組的坐骨神經(jīng)修復(fù)效果要優(yōu)于其他組，這也證實了顱腦損傷可以與他克莫司協(xié)同促進坐骨神經(jīng)損傷后的修復(fù)，其作用機制與他克莫司不完全相同。

在Sunderland V型的外圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)損傷切斷了神經(jīng)內(nèi)分泌的養(yǎng)分，不能將其輸送到靶子器官上，靶子器官將失去活性和營養(yǎng)的支持[23-24]。根據(jù)目前的他克莫司促進神經(jīng)機制，促進外圍神經(jīng)修復(fù)相對明確是兩個功能領(lǐng)域，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)功能，形成一個FKBP12的綜合體，加入功能地區(qū)后表達GAP-43，一個超蛋白質(zhì)神經(jīng)生長，并促進形成和擴大神經(jīng)的生長由神經(jīng)脈沖生成的生物電能，靶器官，再生軸突的內(nèi)徑上升，厚厚的神經(jīng)膜層，作用范圍增加[19-20]。這證實了他克莫司有助于恢復(fù)外圍神經(jīng)的營養(yǎng)功能，萎縮身體的部分看起來更容易潰瘍，坐骨神經(jīng)神經(jīng)功能指數(shù)、濕重肌他克莫司組恢復(fù)較好，提示促進外形神經(jīng)損傷的作用，結(jié)合功能或復(fù)雜的FKBP12 地區(qū)來促進表達GAP-43。

在外圍神經(jīng)損傷后，軸突的退化立即發(fā)生，軸突碎片是由巨噬細胞吞噬清除的，新的軸突、未退化的神經(jīng)元延伸到由Schwann細胞組成的內(nèi)膜神經(jīng)的間隙，靶器官逐漸建立聯(lián)系和營養(yǎng)[19]。靶子器官的恢復(fù)Masson染色、辣根過氧化物酶切片顯示，A1組免疫抑制效果優(yōu)于 A2組/B1組/B2組，他克莫司結(jié)合FKBP12，形成鈣復(fù)合物抑制堿(CAN)，抑制T細胞的衰減，并抑制IL-2、IL-3的表達，以生產(chǎn)免疫抑制物[6]被神經(jīng)接收。

周圍神經(jīng)的損傷伴隨著血液神經(jīng)屏障的破壞，刺激纖維增生和巨噬細胞的擴散，形成影響神經(jīng)修復(fù)的疤痕[21-22]。他克莫司可以抑制纖維素的擴散、遷移和生物活性，抑制纖維素的擴散，并通過免疫抑制作用促進神經(jīng)損傷的重建和修復(fù)。Masson 染色觀察到，A1組比A2組/B1組/B2組瘢痕減少；神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，創(chuàng)造微型環(huán)境的因素、Schwann細胞的信號有助于促進軸突再生。神經(jīng)交換的物質(zhì)是軸漿的運輸器官[25]和再生軸芽器官通過內(nèi)膜管再生作用于目標(biāo)器官。軸突內(nèi)物質(zhì)更好地恢復(fù)運輸功能和靶器官的反饋是相互促進的[2]。辣根過氧化物酶染色證明A1組優(yōu)于 A2組/B1組/B2組。免疫神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)與腦損傷修復(fù)有密切的關(guān)系[26]，自主神經(jīng)系統(tǒng)的中心結(jié)構(gòu)被摧毀，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)紊亂、改變或喪失，功能腦細胞的變性，導(dǎo)致Caspase瀑布反應(yīng)性的激活，從而導(dǎo)致神經(jīng)凋亡。

本試驗結(jié)果提示腦損傷伴隨周圍神經(jīng)損傷動物早期應(yīng)用他克莫司后，周圍神經(jīng)修復(fù)再生方面較好，腦損傷、他克莫司均可促進周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)，并且協(xié)同促進神經(jīng)損傷的修復(fù)效果更好，為腦損傷合并周圍神經(jīng)損傷的患者提供了新的治療思路。但腦損傷促進周圍神經(jīng)損傷的具體機制仍需進一步深入研究。