OA 患者滑膜IL-7R 的表達及臨床診斷價值研究

武豪杰，張明輝，朱書濤，王曉

（河南大學淮河醫(yī)院 骨科，河南 開封 475000）

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis OA）是骨科比較常見的疾病，是一種隨著年齡的增長發(fā)病率明顯增加的慢性進行性骨關(guān)節(jié)病，嚴重危害老年人的身體健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計顯示，大于65 歲以上的人群中有50%以上都有膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)[1]。目前膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的主要治療方法是早期采用止痛、保護、延緩軟骨退化等非手術(shù)方法治療，晚期軟骨破壞嚴重需要進行關(guān)節(jié)清理及膝關(guān)節(jié)表面置換等手術(shù)治療[2-3]。在漫長的保守治療和手術(shù)治療中會產(chǎn)生昂貴的治療費用。目前對于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的基因治療正成為世界研究的熱點[4-5]。白介素-7 受體（IL-7R）屬于I 型細胞因襲受體家族成員，IL-7R 是淋巴細胞增殖和分化過程中的必需因子，它在細胞表面的缺失會導致B 和T 淋巴細胞生成障礙[6]。最近的研究發(fā)現(xiàn)在類風濕關(guān)節(jié)炎患者免疫細胞表面，IL-7R 表達明顯增加，阻斷IL-7R可以明顯減輕關(guān)節(jié)炎的嚴重程度[7-8]。目前關(guān)于IL-7R 與膝骨性關(guān)節(jié)炎的研究表明，阻斷IL-7R 能夠降低RANKL 的蛋白表達，抑制RANK/RANKL 信號途徑，降低破骨細胞的形成和成熟，對軟骨細胞也有一定影響[9-10]。本研究主要探討膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（OA）患者滑膜中IL-7R 基因的表達情況，對其臨床診斷價值進行討論，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

OA 組：選取我院骨科進行膝關(guān)節(jié)人工置換術(shù)患者41 例，年齡40-79 歲，平均（66.4±9.2）歲；對照組：選取我院骨科半月板損傷和交叉韌帶損傷進行關(guān)節(jié)鏡手術(shù)資料的患者36 例，年齡26-60歲，平均（38.1±11.3）歲。分別切取兩組患者膝關(guān)節(jié)髕上囊的滑膜組織置于無菌管后直接放入液氮中，30min 后放入-80℃保存。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者符合Kellgren-Lawrence 分級標準的Ⅲ級和Ⅳ級。

1.2 OA 診斷標準

膝痛、關(guān)節(jié)活動時出現(xiàn)骨響、年齡≥40 歲、晨僵時間≤30min、膝關(guān)節(jié)X 射線異常。患者經(jīng)過手術(shù)后等到明確診斷。

1.3 排除標準

患者我其他血液系統(tǒng)、關(guān)節(jié)炎性、免疫系統(tǒng)以及全身系統(tǒng)性疾病。

1.4 實驗方法

（1）基因芯片：取3 例新鮮正常的滑膜組織和10 例新鮮OA 患者的滑膜組織進行基因芯片檢測。并用Real time RT-PCR 對基因芯片結(jié)果進行驗證（委托上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行）。

（2）HE 染色、免疫組化實驗：將滑膜組織置于4%的多聚甲醛溶液中，在4℃固定24h 后進行脫水和石蠟包埋。將所有的標本按4μm 規(guī)格切片后固定于載玻片。將固定好的樣本進行HE 染色實驗和免疫組化實驗。免疫組化法：用3%的過氧化氫對內(nèi)源性過氧化物酶進行封閉，加熱抗原修復，10%正常羊血清孵育，加入一抗，置于4℃冰箱中過夜，用PBS 緩沖液振蕩清洗（各30 min）后分別滴加二、三抗，DAB 顯色，蘇木素復染，常規(guī)封片。

（3）RT-PCR：引物設計：IL-7R引物序列為：5`-CTGTTGGACATCTCGGCCTGT-3`，3`-TATCGCACCTTCTGTAAGTTCG-5`；GAPDH 引物序列為：5`-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3`、3`-GCGACTCATCGAGCACCTC-5`。用Trizol 法對滑膜組織中的總RNA 進行提取，用Applied Biosystems逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA，PCR 擴增IL-7R 基因片段后進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應。對77 例患者的髕上滑膜組織中的IL-7R 表達和膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎中的IL-7R 基因的表達進行檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用（）表示，采用t檢驗，將P＜0.05判定為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 基因芯片

基因芯片結(jié)果如圖1 所示，共對22882 個基因進行了檢測，其中上升表達基因450 個、下降表達基因809 個，IL-7R 基因在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達比膝關(guān)節(jié)正?；そM織低。我們進行了Real Time PCR 分析以驗證基因芯片的結(jié)果，結(jié)果表明IL-7R 在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達顯著低于正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織。

圖1 基因芯片篩查結(jié)果

2.2 RT-PCR 分析

（1）組織總RNA 電泳結(jié)果：電泳結(jié)果顯示RTPCR 具有良好的特異性，見圖2。

圖2 組織總RNA 電泳結(jié)果

（2）IL-7RmRNA 統(tǒng)計學分析：對膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織和正常滑膜組織中的IL-7RmRNA 相對表達量分析顯示，IL-7RmRNA 在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達量（0.13±0.55）顯著低于正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織（0.93±0.12），P=0.001。

（3）RT-PCR 檢測結(jié)果：RT-PCR 結(jié)果證實IL-7R在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達顯著低于膝關(guān)節(jié)正常滑膜組織，見圖3。

圖3 RT-PCR 檢測結(jié)果

2.3 HE 染色結(jié)果

正常組和OA 組滑膜組織的HE 染色情況如圖3 所示，對照組滑膜組織的HE 染色結(jié)果顯示成纖維細胞整齊排列，可見較薄的滑膜襯里且細胞層數(shù)較少（圖4-a）。OA 組的染色結(jié)果顯示滑膜組織有類乳頭樣增生，可見較厚的滑膜襯里且細胞層數(shù)增多，還見有因增生而變大的巨噬細胞及成纖維細胞，此外滑膜的絨毛也變厚且部分出現(xiàn)纖維化（圖4-b）。

圖4 HE 染色結(jié)果

2.4 IL-7R 的免疫組化研究

對膝關(guān)節(jié)正常滑膜組織和OA 滑膜組織免疫組化研究結(jié)果顯示IL-7R 主要在膝關(guān)節(jié)滑膜組織的細胞漿中表達，且OA 滑膜組織中IL-7R 的表達量顯著低于正?；そM織，見圖5。

圖5 免疫組化研究結(jié)果

3 討論

IL-7R 和膝關(guān)節(jié)OA 的關(guān)在國內(nèi)報道較少，本研究以正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織和膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織作為研究對象，采用基因芯片對膝關(guān)節(jié)正?；ず蚈A滑膜進行了檢測。通過基因芯片的篩查，我們發(fā)現(xiàn)IL-7R 基因在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達比膝關(guān)節(jié)正?；そM織低。我們進行了Real Time RT-PCR 分析以進一步對基因芯片結(jié)果進行驗證，結(jié)果證實了IL-7R 在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達顯著低于正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織。相比于傳統(tǒng)PCR 定量分析方法，Real Time RT-PCR 能顯著提高定量的準確度。傳統(tǒng)的定量方法主要通過中點檢測，通過對PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳條帶進行光密度的掃描，其主要缺點在于結(jié)果準確性受PCR 平臺期影響較大。而Real Time RT-PCR 能有效避免該問題，Real Time RT-PCR 能利用Ct 值和起始模板對數(shù)的線性關(guān)系進行定量，且具有很好重現(xiàn)性。

本研究通過使用HE 染色對膝關(guān)節(jié)正常滑膜組織和OA 滑膜組，結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)正?；そM織的HE染色結(jié)果顯示成纖維細胞整齊排列，可見較薄的滑膜襯里且細胞層數(shù)較少。OA 滑膜組織的染色結(jié)果顯示滑膜組織有類乳頭樣增生，可見較厚的滑膜襯里且細胞層數(shù)增多，還見有因增生而變大的巨噬細胞及成纖維細胞，此外滑膜的絨毛也變厚且部分出現(xiàn)纖維化。免疫組化研究結(jié)果表明IL-7R 在滑膜細胞的細胞漿中表達，在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜細胞中的表達量相對于正常膝關(guān)節(jié)滑膜細胞有明顯下降。RT-PCR 進一步證實了該結(jié)果。以上實驗結(jié)果證明了IL-7R 在膝關(guān)節(jié)正?；そM織和OA 滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。

有研究通過用IL-7R 對膠原誘導性關(guān)節(jié)模型進行治療并取得了良好的治療效果[11-12]。還有報道顯示IL7 對Th1 和Th17 細胞有很強激活效應，但是IL7 對于Th2 細胞的激活作用則相對較弱。因此通過阻斷IL-7R 能降低Th1 和Th17 細胞的細胞活性從而降低炎性因子IL-17 和干擾素-β 的表達[13-14]。還有研究證實了通過阻斷IL-7R 能夠有效RANKL 蛋白表達從而抑制了RANK/RANKL 信號通路，進而抑制了破骨細胞的生長，對軟骨細胞也具有一定的影響[15]。

綜上所述，IL-7R 在膝關(guān)節(jié)正常滑膜組織和OA滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。關(guān)于IL-7R 在治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用還有待進一步研究。

IL-7R 和膝關(guān)節(jié)OA 的關(guān)在國內(nèi)報道較少，本研究以正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織和膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織作為研究對象，采用基因芯片對膝關(guān)節(jié)正常滑膜和OA滑膜進行了檢測。通過基因芯片的篩查，我們發(fā)現(xiàn)IL-7R 基因在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達比膝關(guān)節(jié)正?；そM織低。我們進行了Real Time RT-PCR 分析以進一步對基因芯片結(jié)果進行驗證，結(jié)果證實了IL-7R 在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜組織中的表達顯著低于正常的膝關(guān)節(jié)滑膜組織。相比于傳統(tǒng)PCR 定量分析方法，Real Time RT-PCR 能顯著提高定量的準確度。傳統(tǒng)的定量方法主要通過中點檢測，通過對PCR 產(chǎn)物瓊脂糖電泳條帶進行光密度的掃描，其主要缺點在于結(jié)果準確性受PCR 平臺期影響較大。而Real Time RT-PCR 能有效避免該問題，Real Time RT-PCR 能利用Ct 值和起始模板對數(shù)的線性關(guān)系進行定量，且具有很好重現(xiàn)性。

本研究通過使用HE 染色對膝關(guān)節(jié)正?；そM織和OA 滑膜組，結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)正常滑膜組織的HE染色結(jié)果顯示成纖維細胞整齊排列，可見較薄的滑膜襯里且細胞層數(shù)較少。OA 滑膜組織的染色結(jié)果顯示滑膜組織有類乳頭樣增生，可見較厚的滑膜襯里且細胞層數(shù)增多，還見有因增生而變大的巨噬細胞及成纖維細胞，此外滑膜的絨毛也變厚且部分出現(xiàn)纖維化。免疫組化研究結(jié)果表明IL-7R 在滑膜細胞的細胞漿中表達，在膝關(guān)節(jié)OA 滑膜細胞中的表達量相對于正常膝關(guān)節(jié)滑膜細胞有明顯下降。RT-PCR 進一步證實了該結(jié)果。以上實驗結(jié)果證明了IL-7R 在膝關(guān)節(jié)正常滑膜組織和OA 滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。

有研究通過用IL-7R 對膠原誘導性關(guān)節(jié)模型進行治療并取得了良好的治療效果[11-12]。還有報道顯示IL7 對Th1 和Th17 細胞有很強激活效應，但是IL7 對于Th2 細胞的激活作用則相對較弱。因此通過阻斷IL-7R 能降低Th1 和Th17 細胞的細胞活性從而降低炎性因子IL-17 和干擾素-β 的表達[13-14]。還有研究證實了通過阻斷IL-7R 能夠有效RANKL 蛋白表達從而抑制了RANK/RANKL 信號通路，進而抑制了破骨細胞的生長，對軟骨細胞也具有一定的影響[15]。

綜上所述，IL-7R 在膝關(guān)節(jié)正?；そM織和OA滑膜組織中均有表達，但是在OA 滑膜組織中表達量相對降低。關(guān)于IL-7R 在治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用還有待進一步研究。