牛結(jié)節(jié)性皮膚病及其病原檢測方法研究進(jìn)展＊

周雪梅，李應(yīng)國，聶 奎，聶福平＊，王 昱，肖進(jìn)文

（1.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715；2.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局，重慶 400020；3.重慶進(jìn)出口食品安全工程中心，重慶 400020）

牛結(jié)節(jié)性皮膚?。↙umpy skin disease，LSD）又稱牛疙瘩皮膚病或牛結(jié)節(jié)疹，是由牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（Lumpy skin disease virus，LSDV）引起的一種牛的急性、亞急性傳染?。?］。被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須通報(bào)的動物疫病。該病的感染率為5%～85%，病死率為10%；其主要臨床特征為病牛皮膚表面出現(xiàn)大量疙瘩樣結(jié)節(jié)，體溫升高至40℃以上，消瘦，產(chǎn)奶量驟減約50%。同時(shí)，還可致原發(fā)性和繼發(fā)性肺炎；感染的患畜四肢因患滑膜炎和腱鞘炎而引起跛行；患病母畜流產(chǎn)，流產(chǎn)胎兒被結(jié)節(jié)性小瘤包裹，并發(fā)子宮內(nèi)膜炎；公牛暫時(shí)或永久不育［2］；皮張鞣制后具有凹陷或孔洞而造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，對養(yǎng)牛業(yè)危害較大。

1 病原學(xué)

牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSD）與山羊痘病毒（Goatpox virus，GPV）、綿羊痘病毒（Sheeppox virus，SPV）同屬于痘病毒科（Poxviridae）、羊痘病毒屬（Capripoxvirus，CaPV）。電鏡觀察，病毒粒子呈磚塊狀或短管狀，由1個(gè)核、2個(gè)側(cè)體和2層脂質(zhì)外膜組成，大小約為290nm×270nm，屬于較小的痘病毒病毒粒子，是惟一在細(xì)胞漿內(nèi)復(fù)制的有囊膜的雙股DNA病毒［3］。迄今為止，該病毒只有1個(gè)血清型，代表株為Neethling株。而Le Goff根據(jù)不同地區(qū)分離毒株的GPCR基因的同源性差異，將其分為兩類，即同源性高的南非Neethling vaccine株，Neethling vaccine株以及肯尼亞綿羊痘和山羊痘病毒（KSGPV），同源性較低的 NI－2490株以及新近NCBI收錄的毒株。

LSDV廣泛存在于皮膚、真皮損傷部位、結(jié)痂、唾液、鼻汁、牛乳、精液、肌肉、脾臟、淋巴結(jié)等處。病毒粒子可于pH6.6～8.6環(huán)境中長期存活。在4℃甘油鹽水和組織培養(yǎng)液內(nèi)存活4月～6月。干燥病變中的病毒存活1個(gè)月以上，在干燥圈舍內(nèi)可存活幾個(gè)月。病毒耐凍融，置－20℃以下保存，可保持活力達(dá)幾年之久；在－80℃可保存10年。對熱敏感，55℃2h或65℃30min可滅活。對直射陽光、酸、堿和大多數(shù)常用消毒藥（酒精、升汞、碘酒、來蘇爾、福爾馬林、石炭酸等）均較敏感，對氯仿和乙醚也敏感［4］。

經(jīng)BLAST比對，LSDV與SPV、GPV的基因組同源性高［3］。Stram Y 等［5］研究證明，LSDV 與SPV的關(guān)系更為密切。Tulmane R等用限制性內(nèi)切酶的方法分析3種病毒，有相似的電泳圖譜，認(rèn)為這是病毒在不同地區(qū)適應(yīng)不同宿主的結(jié)果。殷震等［6］認(rèn)為LSDV的形成與羊痘病毒屬的特性“屬內(nèi)各成員發(fā)生遺傳性重組，各屬內(nèi)或各屬間的成員則可發(fā)生非遺傳性復(fù)活”有關(guān)。在自然感染狀態(tài)下，羊痘病毒屬的病毒具有明顯的宿主傾向性，對同源宿主的致病力要強(qiáng)于異源動物，LSDV一般不感染山羊和綿羊。GPV、SPV和LSDV還存在著共同的抗原和廣泛的交叉中和反應(yīng)性抗原，用異源動物體分離的病毒制備的疫苗對同源動物具有免疫保護(hù)力。

2 流行病學(xué)

2.1 流行情況

本病以前僅局限于非洲地區(qū)，在非洲中南部流行比較嚴(yán)重，后傳到非洲北部地區(qū)。該病于1929年在贊比亞首次發(fā)生，1943年傳到波扎那，后傳入南非，引起800萬牛只發(fā)病，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。1957年在肯尼亞發(fā)生，1977年毛利塔尼亞、加納、利比里亞均有該病的報(bào)道。1981年－1986年，坦桑尼亞、肯尼亞、津巴布韋、索馬里、喀麥隆均發(fā)生該病，死亡率在20%左右。1989年在以色列單獨(dú)暴發(fā)流行，同年以色列建立了除非洲外第一個(gè)LSD實(shí)驗(yàn)室。近5年來，LSD流行速度加快，并有復(fù)發(fā)的情形出現(xiàn)。2006年4月19日，埃及農(nóng)業(yè)部宣布埃及暴發(fā)LSD，從2006年1月7日到4月9日294 576頭牛感染該病，其中死亡771頭。2006年9月4日，以色列農(nóng)業(yè)部首席獸醫(yī)官宣布以色列發(fā)生LSD疫情，6月20日～9月3日4 000頭牛發(fā)病。2007年12月17日，以色列農(nóng)業(yè)部再次向OIE報(bào)告發(fā)生LSD疫情，2007年6月7日～2007年12月17日4 337頭牛發(fā)病。2009年3月3日，毛里求斯農(nóng)業(yè)部向OIE報(bào)告暴發(fā)2起LSD疫情，74頭牛發(fā)病，死亡2頭，于2008年5月12日疫情得到控制。2009年10月12日，馬里農(nóng)業(yè)部向OIE報(bào)告發(fā)生9起LSD疫情，2008年8月10日～2009年10月12日，8 722頭發(fā)病，死亡12頭，宰殺10頭。2009年10月10日宣布疫情得到有效的控制。2010年2月2日，莫桑比克農(nóng)業(yè)部向OIE報(bào)告莫桑比克發(fā)生4起LSD疫情，并呈地方流行，從2007年1月6日至報(bào)告日期，共有3 092頭牛發(fā)病，死亡5頭。2010年，該病在貝寧、波扎那、布基納法索、馬達(dá)加斯加、納米比亞、尼日尼亞、阿曼、蘇丹、斯威士蘭、多哥、贊比亞、津巴布韋等地區(qū)和國家均有發(fā)生［7］。在我國，1978年謝家麒等在河南扶溝、通許首次發(fā)現(xiàn)LSD［8］，2002年黑龍江省海倫市發(fā)生2起LSD疫情，引起5頭牛發(fā)病，死亡2頭［9］。但該病并未在我國引起流行，也有學(xué)者認(rèn)為我國尚無LSD［10］。但從目前該病的流行趨勢看，已有向非洲以外的世界各地蔓延的可能性，加強(qiáng)對該病的監(jiān)測已非常必要。

2.2 傳染源和易感動物

牛是該病病原的自然宿主，無性別、品種差異。通常情況下普通牛比較易感，亞洲水牛、奶牛也易感。該病感染率在5%～85%，病死率為10%。綿羊、山羊及一些野生動物，如長角羚羊、長頸鹿、黑斑羚可被人工感染［11］，但僅有45%～50%的感染動物表現(xiàn)出臨床癥狀。同一條件下的牛群，隱性感染與急性死亡的臨床表現(xiàn)差異較大，可能與傳播媒介的狀況有關(guān)。

2.3 傳播途徑

LSDV主要通過節(jié)肢動物傳播，庫蚊屬、伊蚊屬和廄螫蠅在傳播過程中起著非常重要的作用，有觀點(diǎn)認(rèn)為病毒通過牛－昆蟲－牛循環(huán)鏈不斷增殖而引起暴發(fā)。同時(shí)，直接接觸、實(shí)驗(yàn)接種都可能感染該病毒。目前，在沒有傳播媒介的作用下，懷疑可經(jīng)過唾液傳播［12］。

3 病原檢測方法

牛結(jié)節(jié)性皮膚病患牛的急性病變根據(jù)臨床癥狀可初步診斷，但亞急性和非典型病例以及一些與LSD的臨床癥狀相似的疾病，如牛皰疹性乳頭炎、嗜皮菌病、癬、昆蟲或蜱的叮咬、貝諾蟲病、金錢癬、牛皮蠅叮咬、過敏、牛丘疹性口炎、蕁麻疹和皮膚結(jié)核等，因此很難進(jìn)行鑒別診斷。而只能用實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行確診。

3.1 病原分離鑒定

病料采集自病畜活體或死后的皮膚結(jié)節(jié)、肺臟、淋巴結(jié)等，用于病毒分離、培養(yǎng)和檢測常用牛、山羊及綿羊的原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)LSDV，并認(rèn)為從綿羊體內(nèi)分離得到的病原在羔羊睪丸的原代及繼代細(xì)胞培養(yǎng)最為敏感。用透射電子顯微鏡檢查是初步檢查LSDV最直接快速的方法。將病料研磨制成懸濁液，滴1滴懸濁液在臘板上，1min后，加1滴pH 7.8的Tris／EDTA buffer 20s，然后滴加pH 7.2的10g／L的磷鎢酸10s。用濾紙吸干或自然干燥后鏡檢。該病毒粒子呈磚塊狀或短管狀，大小約為290 nm×270nm。

3.2 血清學(xué)檢測

LSDV無血凝素，不能凝集紅細(xì)胞，因此，不能應(yīng)用直接血凝試驗(yàn)［6］。由于LSDV抗體與其他痘病毒引起的牛丘疹性口炎、偽LSD等的抗原之間存在交叉反應(yīng)，瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和免疫熒光抗體試驗(yàn)特異性較低。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的血清學(xué)診斷方法包括間接熒光抗體試驗(yàn)（IFAT）、病毒中和試驗(yàn)（VNT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和蛋白印跡（Western blot）［13］。LSDV 的p32抗原具有很好的敏感性和特異性，但由于蛋白印跡耗費(fèi)較大和操作困難使其在應(yīng)用上有一定的局限性。病毒中和試驗(yàn)常用且特異性最高，但由于LSDV感染主要引起細(xì)胞免疫，產(chǎn)生中和抗體水平低，其檢測靈敏度也較低，對于再次感染或中和抗體水平低的動物，該方法較難確診［14］。Gari G等［15］應(yīng)用間接熒光抗體技術(shù)檢測埃色俄比亞南部地區(qū)（263例）和北部地區(qū)的（200例）病料，其靈敏度和特異性與病毒中和試驗(yàn)的靈敏度和特異性相符合。該方法可用于流行病學(xué)調(diào)查的初步篩選。

以上方法僅適用于該病流行地區(qū)的檢測，但沒有流行的地區(qū)由于沒有接種LSDV活毒苗的，上述檢測方法難以進(jìn)行。Carn V M等［16］構(gòu)建了綿羊痘KS－1株P(guān)32重組抗原，并與LSDV抗體反應(yīng)進(jìn)行間接ELISA檢測，建立了用于檢測從山羊、綿羊、牛的活組織樣品中分離的羊痘病毒的抗原捕捉ELISA方法，該法適合檢測組織培養(yǎng)物中的病毒。Heine H G等［17］應(yīng)用痘苗病毒H3L基因的同源基因p32，構(gòu)建LSDV Neethling株的原核表達(dá)載體，并以該重組蛋白作為抗原建立了具有較高特異性的間接ELISA方法。全長P32表達(dá)量較低，截短的P32表達(dá)量有所提高，但對抗原性有影響。國內(nèi)外不少研究人員正研究CaPV其他特異性強(qiáng)，表達(dá)量高的功能基因。

3.3 分子生物學(xué)檢測

GPV、SPV和LSDV之間存在共同的抗原和廣泛的交叉中和反應(yīng)性抗原，因此，血清學(xué)檢驗(yàn)方法不能鑒別GPV、SPV和LSDV。核酸診斷技術(shù)相對于血清學(xué)診斷特異性較高。通過限制性片段長度多態(tài)性分析（PCR－RFLP）可以鑒別 SPV、GPV 和 LSDV。Ireland D等［18］根據(jù)吸附蛋白和融合蛋白等山羊痘病毒屬的特異性蛋白基因，建立了用于活體或組織培養(yǎng)的山羊痘病毒屬病毒的PCR檢測方法，利用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和DraⅠ的識別位點(diǎn)來證實(shí)PCR產(chǎn)物的特異性。Heine D N等［19］基于痘苗病毒H3L基因的同源基因P32，建立了區(qū)分正痘病毒和副痘病毒的PCR方法。利用限制性內(nèi)切酶EcoⅤ對LSDV與SPV的特性，從而鑒別LSDV與SPV。Stram Y等［20］比較了LSDV與綿羊痘病毒和山羊痘病毒的全長基因組，根據(jù)其末端不同源區(qū)，設(shè)計(jì)引物，建立了鑒別LSDV、SPV和GPV的PCRRFLP方法。同時(shí)，將其與GenBank中收錄的SPV、GPV及LSDV其他毒株的末端序列（774位～1237位）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，可區(qū)分山羊痘病毒、綿羊痘病毒和LSDV，但不能區(qū)分不同地區(qū)的毒株。Le Goff C［21］又根據(jù)G蛋白偶聯(lián)基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，鑒定了不同地區(qū)的LSDV毒株。

Zheng M等［22］采取了雙重PCR方法對山羊痘病毒、綿羊痘病毒與其他痘病毒進(jìn)行了研究，可不用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定其屬的特異性，其靈敏度和特異性均較高。Markoulatos P等［23］建立了多重PCR技術(shù)檢測皮膚組織中的SPPV，采用3對引物，同時(shí)擴(kuò)增，比一對引物的PCR方法具有更高的敏感性和特異性。這提示我們可針對同屬的其他幾個(gè)病毒如LSDV的多個(gè)特征性基因設(shè)計(jì)多條引物，進(jìn)行擴(kuò)增，從而建立LSDV的多重PCR技術(shù)。

Babiuk S等［24］用實(shí)時(shí)定量PCR法對人工感染的LSDV牛皮膚等組織中的病毒進(jìn)行了定量研究，同時(shí)與病毒分離法、顯微鏡觀察進(jìn)行了比較。Lamien C E等［25］根據(jù)羊痘G蛋白偶聯(lián)因子受體特有的分子信號，制備二元雜交探針，成功建立了羊痘病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，通過熔解曲線的不同區(qū)分SPV、GPV及LSDV。

目前，我國對牛結(jié)節(jié)性皮膚病的診斷技術(shù)研究較少，僅在1978年采用病毒分離、電鏡觀察、動物接種等方法對我國首例LSDV進(jìn)行報(bào)道。只是對與LSDV同屬的羊痘病毒屬的GPV、SPV進(jìn)行了研究，已經(jīng)成功構(gòu)建山羊痘病毒、綿羊痘病毒P32基因的真核和原核表達(dá)系統(tǒng)，已建立了檢測山羊痘病毒抗體的間接ELISA方法。近年來又開辟了功能性基因的研究。從而我們可以參照山羊痘、綿羊痘病毒的研究方法進(jìn)行牛結(jié)節(jié)性皮膚病檢測技術(shù)的研究。

4 小結(jié)

目前，我國境內(nèi)未發(fā)生過牛結(jié)節(jié)性皮膚病，尚無檢測該病的成熟技術(shù)。隨著我國加入WTO后，與國際間的貿(mào)易往來日益頻繁，大量的種牛、種羊引進(jìn)，且該病已有在從非洲大陸傳入其他地區(qū)的趨勢，我國存在大量的易感動物，因此，該病傳入我國的可能性較大，應(yīng)加快對該病診斷技術(shù)和疫苗的研究，加強(qiáng)口岸的監(jiān)管，以有效防止該病的傳入。

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