寧夏地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥性分析

王桂琴，楊萌萌，邢 燕，尹力媛，劉 偉，馮若洋

（寧夏大學農學院，寧夏銀川750021）

寧夏地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥性分析

王桂琴，楊萌萌，邢 燕，尹力媛，劉 偉，馮若洋

（寧夏大學農學院，寧夏銀川750021）

為了解寧夏地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的耐藥情況，采用藥敏紙片擴散法，測定了50株奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌對常用的17種抗菌藥物的耐藥性。同時采用產色頭孢菌素法進行β－內酰胺酶的檢測，并采用苯唑西林紙片法進行耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測。結果表明，所有菌株除了對利福平、萬古霉素100%敏感以外，對其他15種藥物均產生不同程度的耐藥性，其中耐藥率較高的有青霉素、氨芐西林、紅霉素、頭孢唑啉及克林霉素，耐藥率較低的為阿米卡星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、頭孢噻肟及多西環(huán)素。50株金黃色葡萄球菌中，有25株產β－內酰胺酶，產酶率為50%，未檢測出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

乳房炎；金黃色葡萄球菌；耐藥性；β－內酰胺酶；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

奶牛乳房炎是微生物感染或理化刺激引起的一種奶牛乳腺炎癥，是造成奶牛業(yè)損失最嚴重的疾病之一，全世界約有1/3的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎［1］。引起奶牛乳房炎的主要原因是感染病原微生物，可由多種病原菌共同或單獨引起。迄今為止，人們已從奶牛乳房中分離到了150多種微生物，包括多種細菌、真菌、病毒、支原體等，其中金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病菌?，F(xiàn)階段國內外仍主要采用抗生素治療乳房炎，但由于抗生素的大量使用及濫用，導致細菌產生耐藥性而降低了療效，而且使奶中抗生素的殘留增加。

青霉素的問世曾使金黃色葡萄球菌感染得到強有效的控制，但隨之產生的對抗菌藥物的耐藥問題，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin－resistantStaphylococcusaureus，MRSA）的出現(xiàn)，給臨床治療提出了新的挑戰(zhàn)。MRSA不但對甲氧西林耐藥，而且通常對所有β－內酰胺類抗菌藥物及其他多種抗菌藥物均有耐藥性［2］，導致臨床可選用的藥物非常有限，由金黃色葡萄球菌和MRSA引起的疾病和死亡大大增加［3］。因此，監(jiān)測其耐藥性的變化可指導臨床用藥，避免抗菌藥物的濫用，從而減少耐藥菌株的產生。

寧夏地區(qū)奶牛業(yè)發(fā)展快速，但獸醫(yī)臨床上的不合理和濫用藥物非常嚴重，這對治療感染性疾病極其不利。因此，本研究對寧夏部分奶牛場乳房炎分離的金黃色葡萄球菌進行了體外藥敏試驗、篩選MRSA菌株和調查產β－內酰胺酶情況，以期為臨床合理用藥、預防和治療乳房炎提供參考，促進奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并為乳房炎病原菌耐藥機制的研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 株 從寧夏地區(qū)部分奶牛場362份乳房炎奶樣中分離的金黃色葡萄球菌。質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923為中國藥品與生物制品檢定所產品。

1.1.2 抗菌藥物藥敏紙片 青霉素（10單位/片）、氨芐西林（10μg/片）、頭孢唑啉（30μg/片）、頭孢西?。?0μg/片）、環(huán)丙沙星（5μg/片）、氧氟沙星（5 μg/片）、諾氟沙星（10μg/片）、紅霉素（15μg/片）、克林霉素（2μg/片）、阿米卡星（30μg/片）、四環(huán)素（30μg/片）、多西環(huán)素（30μg/片）、萬古霉素（30 μg/片）、頭孢噻肟（30μg/片）、利福平（30μg/片）、卡那霉素（30μg/片）、復方新諾明（1.25μg/片）、苯唑西林（1μg/片），均為中國北京天壇藥品與生物制品股份有限公司產品。

1.1.3 主要培養(yǎng)基及試劑 MH培養(yǎng)基、MH瓊脂為北京奧博星生物技術有限公司產品；高鹽甘露醇培養(yǎng)基為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產品；β－內酰胺酶快速檢測試劑盒為法國BioMerieux，sa公司產品；奶牛乳房炎診斷液 （Lanzhou mastitis test，LMT）為中國農業(yè)科學院中獸醫(yī)研究所藥廠產品。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 奶樣采自寧夏地區(qū)不同規(guī)模、不同管理水平的6個奶牛場 ，乳房炎檢測的方法和結果判定依據中國農業(yè)科學院中獸醫(yī)研究所藥廠生產的奶牛乳房炎診斷液產品說明書。乳房炎檢測之后，采集隱性和臨床型乳房炎的奶樣。牛只按常規(guī)擠奶消毒后，每個乳頭擠去頭兩三把乳后無菌取乳樣5mL左右，貼好標簽，4h內送檢。

1.2.2 金黃色葡萄球菌的分離、鑒定 將采集的乳樣涂于高鹽甘露醇培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，觀察其菌落形態(tài)特征，挑取黃色的較小菌落于肉湯培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h后用微生物鑒定系統(tǒng)Microbial Identification System Version 6.1進行鑒定。

1.2.3 β－內酰胺酶的檢測 在室溫下將產頭孢菌素紙片放置于培養(yǎng)皿中，用無菌蒸餾水浸濕紙片，然后沾取少量待檢測菌菌落到紙片表面，原黃色紙片出現(xiàn)紅色則為陽性結果，1h后如果無任何顏色變化仍為黃色的則為陰性。

1.2.4 金黃色葡萄球菌體外抑菌試驗 按文獻［4］推薦的紙片法進行，使用ATCC25923作為質控菌。試驗結果判定標準按照美國臨床檢驗標準委員會（CLSI）制定的標準執(zhí)行，最后對數據進行統(tǒng)計處理。

1.2.5 MRSA菌株的檢測 采用CLSI推薦的苯唑西林紙片擴散法，苯唑西林的含量為1μg/片，如抑菌環(huán)≤10mm為耐藥，≥13mm則為敏感，11min～12mm為中間耐藥。

2 結果

2.1 乳樣中金黃色葡萄球菌的分離情況

本次試驗共采集362份乳樣，經微生物鑒定系統(tǒng) Microbial Identification System Version 6.1鑒定，共鑒定出50株金黃色葡萄球菌，細菌分離率為13.81%。

2.2 金黃色葡萄球菌對17種抗菌藥物的敏感性

50株金黃色葡萄球菌對臨床常用的17種抗菌藥物的耐藥率情況見表1。由表1可以看出，分離菌對利福平、萬古霉素的敏感性都達到了100%，對阿米卡星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、多西環(huán)素、頭孢西丁及復方新諾明的敏感性都在85%以上。而對青霉素、氨芐西林、克林霉素、頭孢唑啉、紅霉素的耐藥率達到了40%以上，其中耐藥率較高的是青霉素、氨芐西林及紅霉素。

表1 50株金黃色葡萄球菌對17種抗菌藥物的耐藥率Table1 The resistant rate of 50 Staphylococcusaureus strains to 17antimicrobial agents

2.3 金黃色葡萄球菌多重耐藥分析

此次臨床分離的金黃色葡萄球菌多藥耐藥情況比較嚴重，50株金黃色葡萄球菌中，除3株對17種藥物都敏感外，其余菌株都有不同程度的耐藥性，其中3耐的菌株有9株，所占比例最大，占所有菌株的18%，其次為6耐、5耐、4耐及7耐的菌株，所占比例分別為14%、14%、10%及4%。所有分離的多重耐藥菌株中最多達到12耐（圖1）。由圖可見，7耐以上的菌株占18%，若同時耐3種藥物即可歸為多藥耐藥，那么50株金黃色葡萄球菌的多藥耐藥率為74%。

2.4 β－內酰胺酶的檢測結果

采用產色頭孢菌素法，對50株金黃色葡萄球菌進行β－內酰胺酶的檢測，本次試驗篩選出25株產β－內酰胺酶的金黃色葡萄球菌，產酶率為50%。

從表2可見，與β－內酰胺酶陰性葡萄球菌相比，β－內酰胺酶陽性菌表現(xiàn)多重耐藥性。除萬古霉素和利福平外，對其他的抗菌藥均呈現(xiàn)不同程度耐藥，其中青霉素G、頭孢唑啉耐藥率均為92%、氨芐西林為88%，紅霉素、克林霉素為68%，卡那霉素為36%，其他的均在30%以下。

圖1 金黃色葡萄球菌對17種抗菌藥物的多藥耐藥情況Fig.1 Multi－drug resistance of Staphylococcusaureus to 17 antimicrobial agents

2.5 MRSA耐藥表型鑒定結果

采用紙片擴散法對50株金黃色葡萄球菌進行MRSA的檢測，以CLSI標準判讀，本次試驗未篩選出耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌。

表2 β－內酰胺酶陽性金黃色葡萄球菌與陰性菌的耐藥率Table 2 The resistant rate of Staphylococcusaureus strains producingβ－lactamase and negative strains

3 討論

青霉素類和頭孢菌素類均屬于β－內酰胺類抗生素，本次試驗選用青霉素類藥為青霉素和氨芐西林。其中對青霉素產生耐藥的有43株菌，占總菌株數的86%，對氨芐西林產生耐藥的菌株數為36株，占總菌數的72%。這與史冬燕等［5］報道的金黃色葡萄球菌對青霉素和氨芐西林的耐藥率分別為91.67%和65%相似。

本次試驗結果顯示，菌株對卡那霉素耐藥率為26%，該結果與劉朝等［6］所報道的金黃色葡萄球菌對卡那霉素的耐藥率為27.3%比較接近；菌株對阿米卡星的耐藥率為6%，這與李乾學等［7］報道的金黃色葡萄球菌對該藥物的耐藥率為6%完全相同。結果表明牛源金黃色葡萄球菌對氨基糖苷類抗菌藥物的敏感性較高。

本次試驗中，分離菌株對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星的敏感率均達到了85%以上，這與徐勤等［8］的研究結果很相近，這可能是因為寧夏在牛的疾病治療中，氟喹諾酮類藥物使用較合理，這類藥物的耐藥率與其他地區(qū)也很相近，敏感率較高。

本次試驗檢測到的金黃色葡萄球菌產酶株占50%，這比王冰等［9］報道的內蒙古呼和浩特地區(qū)金黃色葡萄球菌產酶率94.81%低很多，可見產酶株的發(fā)生在各地區(qū)存在差異，與各地區(qū)使用抗生素的情況不同有關。

耐甲氧西林葡萄球菌是重要的人畜共患病病原菌。它不僅是人類感染的重要感染菌之一，而且在多種動物上呈現(xiàn)出感染上升的趨勢。目前在羊、豬、雞、馬、狗等動物，以及牛奶、肉類等食品中都分離到該病原菌。在一些國家和地區(qū)，人類感染耐甲氧西林葡萄球菌的比率較高，一般大于50%［10］，而動物感染耐甲氧西林葡萄球菌的比率變化很大，在0.18%～49%之間［11－13］。而本次試驗未篩選出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，這與王教玉等［14］報道的雞、豬的MRSA比例高達48.8%差異極大，這可能是由于動物異源性和臨床用藥差異而造成的，也說明了寧夏這幾個奶牛場耐藥情況還不是很嚴重。

［1］ 卜仕金，陳杖榴，馮淇輝.奶牛乳房炎的抗菌藥物防治［J］.獸藥與飼料添加劑，1999，4（3）：14－16.

［2］ 歐陽范獻.MRSA的SCCmec分子分型及其耐藥性研究［D］.海南?？冢喝A南熱帶農業(yè)大學，2007.

［3］ 黃 怡.細菌耐藥機制的研究現(xiàn)狀［J］.國外醫(yī)學：徽生物學分冊，2000，23（1）：24－26.

［4］ CLSI.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；Fifteenth informational supplement：M100－S15［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，Wayne PA：USA，2005.

［5］ 史冬燕.奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌耐藥性及以黏附素為靶位的疫苗的基礎研究［D］.內蒙古呼和浩特：內蒙古農業(yè)大學，2010.

［6］ 劉 朝，王京仁，張成棟，等.湖北地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與耐藥性分析［J］.中國奶牛，2007（7）：35－38.

［7］ 李乾學，閻繼業(yè)，鄧旭明，等.吉林省動物源性金黃色葡萄球菌和鏈球菌的耐藥性監(jiān)測［J］.吉林畜牧獸醫(yī)，2002（6）：7－8.

［8］ 徐 勤，巢國祥.生奶中金黃色葡萄球菌污染狀況及耐藥性狀研究［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2005，15（8）：972－973.

［9］ 王 冰，劉明春，吳聰明，等.呼和浩特地區(qū)奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌的耐藥性調查［J］.中國獸醫(yī)雜志，2007，43（3）：30－32.

［10］ Lee J H，Jeong J M，Park Y H，et al.Evaluation of the methicillin－resistantStaphylococcusaureusscreen latex agglutination test for detection of MRSA of animal origin［J］.J Clin Microbiol，2004，42（6）：2780－2782.

［11］ Kwon N H，Park K T，Moon J S，et al.Staphylococcal cassette chromosome mec（SCCmec）characterization and molecular analysis for methicillin－resistantStaphylococcusaureusand novel SCCmec subtypeⅣg isolated from bovine milk in Korea［J］.J Antimicrob Chemother，2005，56（4）：624－632.

［12］ Smith T C，Male M J，Harper A L，et al.Methicillin－resistantStaphylococcusaureusstrain ST398is present in midwestern US swine and swine workers［J］.Plosone，2009，4（1）：1－6.

［13］ van Loo I H，Diederen B M，Savelkoul P H，et al.Methylicillin－resistantStaphylococcusaureusin meat products，the Netherlands［J］.Emerg Infect Dis，2007，13（11）：1753－1755.

［14］ 王教玉，韓文瑜，雷連成，等.動物源性耐甲氧西林葡萄球菌耐藥表型及基因型鑒定［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（2）：89－92.

Resistant Analysis ofStaphylococcusaureusIsolated from Bovine Mastitis in Ningxia

WANG Gui－qin，YANG Meng－meng，XING Yan，YIN Li－yuan，LIU Wei，F(xiàn)ENG Ruo－yang

（SchoolofAgriculture，NingxiaUniversity，Yinchuan，Ningxia，750021，China）

In order to find out the antimicrobial resistance ofStaphylococcusaureusisolated from bovine mastitis in Ningxia，were determined the antimicrobial resistance of 50Staphylococcusaureusstrains to 17 antibiotics by means of the methods of disk diffusion，and β－lactamase and methicillin－resistantStaphylococcusaureus（MRSA）were detected.The results showed that all strains were susceptible to vancomycin and rifampicin.The other 15antibiotics had different degrees of resistance，which had a high resistance to penicillin，ampicillin，erythromycin，cefazolin and clindamycin.The resistant rate was lower to amikacin，ciprofloxacin，ofloxacin，norfloxacin，cefotaxime and doxycycline.The isolates that secreted β－lactamase were 25strains，the rate of producing β－lactamase was 50%. Methicillin－resistantStaphylococcusaureuswas not detected.

mastitis；Staphylococcusaureus；antimicrobial resistance；β－lactamase；methicillin－resistant－Staphylococcusaureus

S858.23

A

1007－5038（2011）10－0059－04

2011－04－12

寧夏大學大學生創(chuàng)新試驗項目資助

王桂琴（1970－），女，河北清苑縣人，副教授，博士，主要從事細菌耐藥性研究。