黃柏堿改善膿毒癥大鼠急性腎損傷的作用及機制研究

姜盈盈，林 岳

黃柏最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，主要來源于蕓香科植物黃皮樹（Phellodendron chinense Schneid）的干燥樹皮，具有清熱燥濕、解毒療瘡等功效。研究發(fā)現(xiàn)，黃柏的藥理活性主要表現(xiàn)為抗炎、抗菌、抗病毒及抗氧化等[8]。近來發(fā)現(xiàn)，由黃柏、黃連等組方而成的黃連解毒湯在膿毒癥的治療中療效顯著，同時發(fā)現(xiàn)黃柏堿是其中重要的入血成分[9]。黃柏堿為黃柏中的關鍵生物堿成分，其具有良好的降血壓和抗腎炎等活性[10-11]。黃柏堿參與了膿毒癥及腎炎的治療過程，而其對于膿毒癥并發(fā)急性腎損傷（AKI）是否存在潛在作用尚不清楚。因此本課題擬采用膿毒癥大鼠模型，通過治療考察黃柏堿的藥效活性、分析其潛在藥理機制，為膿毒癥并發(fā)AKI的治療提供新的治療策略，為黃柏及其相應組方的臨床運用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF級SD大鼠，雄性，8周齡，體重180～220 g，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2017-0005），購自上海斯萊克實驗動物有限公司。大鼠飼養(yǎng)于層流架中，自由進食飲水，造模前12 h晝夜交替飼養(yǎng)3 d，保持恒溫條件。

1.2 主要試劑及儀器 黃柏堿（HPLC≥98%，H-100718-03），成都瑞芬思生物科技有限公司；Cr、BUN試劑盒，南京建成生物工程研究所；NGAL、KIM-1、IL-6、IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒，北京博奧森生物技術有限公司；HE染色試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司；全蛋白提取試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司；TLR4及NLRP3抗體，美國Abcam公司；ECL顯影試劑盒，美國GE公司；SDS-PAGE試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司。垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，上海天能科技有限公司；凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國GE公司；組織脫水機、包埋機，日本櫻花精機株式會；AX70顯微系統(tǒng)，日本Olympus公司；MK3型酶標儀，美國Bio-Rad公司。

1.3 模型建立 取健康大鼠，采用盲腸結扎穿刺術（CLP）方法[12]制備膿毒癥大鼠模型。首先采用戊巴比妥鈉進行麻醉，在無菌工作臺中沿腹正中線切開，暴露大鼠盲腸。4-0絲線環(huán)形結扎盲腸末端1.5 cm處，18號針頭在游離端穿透2次，擠出少許糞便，還納腸管并逐層縫合腹壁切口。假手術大鼠僅探查盲腸，不結扎或穿孔。

1.4 分組與給藥 造模結束，取膿毒癥大鼠隨機分為4組：模型組、黃柏堿低劑量組（100 mg/kg）、黃柏堿高劑量組（200 mg/kg）及氨芐青霉素鈉組（150 mg/kg），另取假手術大鼠設為假手術組，每組10只。給藥組尾靜脈注射相應劑量藥物，假手術組及模型組大鼠則給予0.5 mL生理鹽水。術后24 h眼眶取血，離心收集血清，隨后脫頸椎處死大鼠，取出腎臟，部分組織浸泡于10%甲醛溶液，部分勻漿后取上清液，剩余腎臟組織置凍存管，并放入-80℃冰箱保存。

1.5 血清生化指標測定 根據(jù)試劑盒說明書進行操作，檢測大鼠血清中腎損傷指標（Cr、BUN、NGAL及KIM-1）以及炎性因子（IL-6、IL-1β及TNF-α）的含量。

1.6 腎臟病理變化檢測 從10%甲醛溶液中取出腎組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、脫二甲苯、核染、分化與漂洗、染色、脫水、透明和封片，在光鏡下對腎組織病理改變進行觀察。根據(jù)管狀上皮增生、刷狀緣消失、空泡變性及上皮脫落等鏡檢指標進行觀察。

1.7 免疫印跡法檢測腎組織中TLR4及NLRP3蛋白表達 取腎組織全蛋白抽提液，根據(jù)BCA試劑盒說明書對上清液中蛋白含量進行測定。經(jīng)上樣緩沖液孵育后，各組取等量蛋白進行凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。經(jīng)BSA封閉后加一抗TLR4（1:1000）及NLRP3（1:1000）在4℃進行雜交孵育。次日在室溫中加二抗進行孵育，通過滴加ECL顯影液進行顯影成像，根據(jù)Image J軟件進行灰度值半定量分析。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平比較 與假手術組大鼠比較，模型大鼠血清中炎癥因子（TNF-α、IL-6及IL-1β）水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在TNF-α含量檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯抑制TNF-α的分泌，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）；在IL-6含量檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯抑制IL-6的分泌，其中以黃柏堿高劑量的作用顯著（P＜0.01）；在IL-1β含量檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉均可顯著抑制IL-1β的分泌（P＜0.01）。結果見表1。

2.2 各組大鼠血清Cr及BUN含量比較 與假手術組大鼠比較，模型大鼠血清中腎功能指標（Cr及BUN）水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在Cr含量檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低Cr的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）；在BUN含量檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低BUN的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）。結果見表2。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β含量的比較

表2 各組大鼠血清Cr及BUN含量的比較

2.3 各組大鼠血清NGAL及KIM-1含量比較 與假手術組大鼠比較，模型大鼠血清中腎損傷標志物（NGAL及KIM-1）水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在NGAL含量檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低NGAL的含量，其中以黃柏堿高劑量的作用顯著（P＜0.01）；在KIM-1含量檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低KIM-1的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組大鼠血清NGAL及KIM-1含量的比較

2.4 各組大鼠腎臟組織病理結果 通過組織病理檢測發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腎組織間隙出現(xiàn)明顯水腫，可見彌漫嗜中性粒細胞浸潤，腎小球嚴重皺縮，而腎小管官腔閉塞，部分細胞腫脹、空泡變性，腎小管囊腔擴張等。再給予黃柏堿低、高劑量及氨芐青霉素鈉治療后，大鼠腎組織中可見腎小管灶狀損害減輕，腎小管腫脹及空泡變性也均有改善，炎性細胞浸潤及組織間隙水腫得到不同程度緩解，其中以黃柏堿高劑量及氨芐青霉素鈉的改善較佳。結果見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織HE染色

2.5 各組大鼠腎臟組織TLR4及NLRP3蛋白表達比較 與假手術組大鼠比較，模型大鼠腎組織中TLR4表達水平顯著提升（P＜0.01）。與模型大鼠比較，在TLR4水平檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉均可顯著降低組織中TLR4蛋白表達水平（P＜0.01）；在NLRP3水平檢測后發(fā)現(xiàn)，黃柏堿低、高劑量與氨芐青霉素鈉可明顯降低NLRP3的含量，其中以黃柏堿高劑量與氨芐青霉素鈉的作用顯著（P＜0.01）。結果見表4、圖2。

表4 各組大鼠腎臟組織TLR4及NLRP3表達水平的變化

圖2 各組大鼠腎臟組織TLR4及NLRP3表達水平的變化

3 討論

膿毒癥是指因病原體入侵機體后導致的一系列持續(xù)性過度炎癥及持續(xù)性免疫抑制反應，是機體器官衰竭的重要因素，可導致患者休克甚至死亡[1]。膿毒癥是臨床常見的全身性危重綜合癥，在重癥監(jiān)護病房 (intensive care unit，ICU)中其病死率高達35%[2]，嚴重威脅患者生命健康安全，給社會及患者家庭帶來沉重負擔[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者中并發(fā)AKI的風險高達50%，且該類患者預后較差，死亡率較高[5-6]。臨床常通過補液、靜脈滴注抗生素及利尿劑等策略實施膿毒癥AKI的治療，但膿毒癥AKI患者的高死亡率并未得到有效緩解[7]，因此探索新的膿毒癥AKI治療藥物，對緩解腎臟損傷、挽救患者生命與健康具有重大意義。

AKI是ICU期間常見的并發(fā)癥，由多種致病因素（膿毒癥、缺血缺氧及藥毒性）誘發(fā)而導致短期內(nèi)腎功能快速下降。AKI臨床表現(xiàn)主要包括腎小球濾過率降低、水電解質(zhì)紊亂、肌酐升高及尿量減少等。AKI通常伴有嚴重并發(fā)癥，通過干擾其他生理系統(tǒng)，導致體內(nèi)多臟器衰竭[13]，嚴重并發(fā)癥可使患者病死率提升至30%[14]。膿毒癥是AKI的主要因素[15]，中醫(yī)認為膿毒癥屬“傷寒”“熱病”范疇，通常將其病機歸為“毒瘀互結”，而其所致AKI則為機體正氣虧虛，外感溫熱毒邪引發(fā)三焦失司，繼而累及臟腑[16]，因此常采用清熱解毒法進行治療[17-19]。本課題通過大鼠CLP，使得含大量菌群的腸內(nèi)容物污染腹腔，誘發(fā)彌漫性腹膜炎，導致廣泛的全身性、自我破壞性炎癥反應。該膿毒血癥模型可有效模擬臨床膿毒癥患者的血液動力學、炎癥反應及代謝變化[20]。此外，由于氨芐青霉素鈉作為抗菌藥，在臨床膿毒血癥病情控制中發(fā)揮著重要作用[21]，也是膿毒血癥體內(nèi)實驗中常用的陽性對照藥，可通過控制細菌感染從而緩解膿毒血癥并發(fā)癥[22]，故將其作為陽性對照藥?；邳S柏為清熱燥濕、解毒療瘡的傳統(tǒng)中藥，本實驗擬圍繞其核心成分黃柏堿展開研究，考察其治療膿毒癥AKI的作用及相關機制。

研究認為，膿毒血癥通過調(diào)控血流動力學、內(nèi)毒素、炎性因子、細胞凋亡及免疫抑制等因素直接參與AKI的形成[23]，而炎癥介質(zhì)的過度釋放與膿毒癥AKI的發(fā)生、發(fā)展存在直接聯(lián)系。TNF-α、IL-6及IL-1β作為標志性炎癥介質(zhì)，在膿毒癥血清中明顯增加[24]。研究表明，TNF-α、IL-6及IL-1β可通過誘導腎小球中性粒細胞浸潤及單核細胞轉(zhuǎn)移，最終導致腎臟受損[25]。同時有證據(jù)發(fā)現(xiàn)，降低上述炎癥因子的水平可有效緩解膿毒癥AKI[26]。實驗結果發(fā)現(xiàn)，膿毒癥AKI大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β水平顯著上升，腎臟病變嚴重；通過黃柏堿干預后可有效降低大鼠血清中該類炎癥因子含量，且不同程度地緩解腎臟病變。由此提示，黃柏堿可能通過下調(diào)體內(nèi)炎癥水平，繼而達到減輕膿毒癥AKI的作用。

NGAL和KIM-1是近年來發(fā)現(xiàn)的與膿毒癥AKI診斷緊密關聯(lián)的生物標志物。生理條件下，NGAL主要在中性粒細胞及腎小管上皮細胞中低水平表達[27]，當機體處于病理改變時其表達迅速增加。研究發(fā)現(xiàn)，缺血或腎毒性模型小鼠體內(nèi)NGAL表達增加[28]，同時亦當作幼兒行體外循環(huán)后發(fā)生AKI的判斷依據(jù)[29]。因此NGAL可被看作為早期的、靈敏的AKI標記物。KIM-1主要在腎臟近曲小管上皮細胞低表達，當處于AKI時，其表達量顯著增加。KIM-1可促進上皮細胞黏附，因此AKI改善后期表達量也逐步降低直至損傷修復[30-31]。由于KIM-1具有高度的敏感性與特異性，因此也是良好的AKI診斷指標。同時在科研及臨床中，Cr與BUN通常是評價腎功能的金指標，Cr可較好的反映早期腎損傷程度，而BUN可間接反映腎臟的排泄能力[32]。研究結果表明，黃柏堿可有效降低膿毒癥AKI大鼠體內(nèi)腎損傷標志物（NGAL和KIM-1）水平，改善腎功能指標（Cr與BUN）分泌。由此提示，黃柏堿可通過減輕腎損傷、改善腎功能，繼而在膿毒癥AKI進程中達到保護腎臟的作用。TLR4與NLRP3作為固有免疫系統(tǒng)的識別受體，廣泛分布于免疫細胞及體內(nèi)器官中。當病原微生物感染機體后，通過分泌內(nèi)毒素激活TLR4信號通路，繼而激活下游一系列信號通路（如NF-κB通路）[33]，促進TNF-α、IL-6及IL-1β合成與分泌，加劇炎癥反應[34]。TLR4/NF-κB不僅參與炎癥的調(diào)節(jié)，同時也著重參與NLRP3炎癥復合體的激活[35]。已有研究表明，NLRP3炎癥復合體在AKI的病理進程中占據(jù)關鍵角色，可同時促進血清Cr升高，增加中性粒細胞浸潤，同時將IL-1β前體轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β并釋放到細胞外，促進炎癥反應[36-37]。其中NLRP3蛋白的表達則可視為炎癥復合體激活的限速靶點[38]。研究結果顯示，膿毒癥AKI大鼠腎組織中TLR4與NLRP3表達水平顯著增加，而黃柏堿干預后可明顯抑制TLR4與NLRP3的表達。由此提示，黃柏堿可能通過調(diào)控TLR4/NLRP3信號通路，繼而達到改善膿毒癥AKI的作用。

綜上所述，黃柏堿可有效減少膿毒癥AKI大鼠血清中TNF-α、IL-6及IL-1β的分泌水平，從而緩解腎臟損傷的病理進程。由于黃柏堿的腎臟保護作用，使得大鼠血清中腎損傷標志物（NGAL和KIM-1）的表達及腎功能指標（Cr與BUN）的分泌明顯減少，而上述作用可能與黃柏堿下調(diào)TLR4/NLRP3信號傳導有關。通過本研究，明確驗證了黃柏堿改善膿毒癥AKI的作用，深刻闡釋了其保護腎臟的機制，為膿毒癥AKI的干預提供新的方法與策略，為黃柏的研究及運用提供新思路。