異夏佛塔苷對人非小細胞肺癌A549細胞抗腫瘤的活性及其作用機制

梁 楓，于麗麗，汪榮斌，秦亞東，戴 勝

(1.安徽中醫(yī)藥高等?？茖W校，安徽 蕪湖 241000；2.中國藥科大學，江蘇 南京 210000)

癌癥是嚴重威脅人類健康的疾病之一[1]。據(jù)國內(nèi)最新衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒顯示：原發(fā)性肺癌 (簡稱肺癌) 是最常見的惡性腫瘤之一，同時還位居惡性腫瘤死亡率的第一位[2]。鑒于惡性腫瘤的高發(fā)病率和高死亡率，科研工作者們一直在致力于尋找新的抗腫瘤藥物。在我國中藥抗腫瘤歷史悠久，抗腫瘤中藥種類繁多，資源豐富?，F(xiàn)代藥理研究表明：中藥可以通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和增強機體免疫功能等途徑達到抗腫瘤的目的[3-4]。

天南星來源于植物天南星Arisaema erubescens (Wall.) Schott、異葉天南星A.heterophyllum Bl.或東北天南星A.amurense Maxim.的干燥塊莖[5]。其性味苦、辛，溫，有毒?，F(xiàn)代藥理研究顯示：其具有抗驚厥、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎、祛痰等藥理作用。異夏佛塔苷是天南星黃酮類有效成分之一，目前關(guān)于異夏佛塔苷對人非小細胞肺癌A549細胞的抑制作用研究相對較少。因此，本實驗旨在研究異夏佛塔苷對人非小細胞肺癌A549細胞增殖、細胞凋亡及相關(guān)蛋白表達的影響，為其作為抗腫瘤藥物的進一步開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 異夏佛塔苷(批號:52012-29-0，純度>98%)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購自美國Sigma公司；細胞凋亡流式檢測試劑盒購自美國Bioscience公司；其余無機類試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2 細胞株 人非小細胞肺癌細胞株由中國科學院上海細胞生物研究所提供。

1.1.3 實驗儀器 pH計(上海儀電科學儀器有限公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；雙重純水機(上海亞榮生化儀器廠)；CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；超凈工作臺 (江蘇蘇凈集團有限公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；流式細胞儀(美國Becton Dickinson公司)；半干膜轉(zhuǎn)移印(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 非小細胞肺癌A549細胞在5%CO2、37℃的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，用于實驗研究。

1.2.2 MTT法檢測異夏佛塔苷對A549細胞增殖的作用 收集對數(shù)生長期的非小細胞肺癌A549細胞株，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液,10%FBS的高糖培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，接種于96孔板中，每孔5×103個細胞。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞單層貼壁后，加入含有不同濃度的異夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)的稀釋液，每個濃度設(shè)置3個平行孔，其中陰性對照組為含與實驗組等量細胞的細胞懸液，陽性對照組加入順鉑處理(對照組加入與給藥組等體積的溶劑)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24h、48h和72h后每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)3.5～4.0h；小心棄去原培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μL，振蕩15min；使結(jié)晶充分溶解后，用酶聯(lián)檢測儀于490nm波長處測定各孔的吸光度(A)值，溶劑對照處理的細胞為對照組，計算細胞生長抑制率。

1.2.3 雙染法流式細胞術(shù)檢測異夏佛塔苷對A459細胞凋亡的影響 收集對數(shù)生長期的非小細胞肺癌A549細胞株，以3×105mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板，接種量1.8mL/孔。將上述細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24h,然后加入含不同濃度的異夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)的10%的FBS的高糖培養(yǎng)基(1.8mL/孔)，不加藥組作為空白對照，做好相應的標記，將上述6孔細胞培養(yǎng)板板置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，0.25%胰酶消化A549細胞并收集單細胞懸液，1000g離心5min，棄去上清培養(yǎng)基，收集下層細胞，無菌PBS重懸A549細胞，吸取100μL細胞懸浮液置于EP管中，再加入10μL的AnnexinV-Alexa Fluor488、5μL的PI以及400μL的binding buffer,室溫避光孵育30min[6]。流式細胞儀檢測不同濃度的異夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)對A549細胞凋亡的影響。

1.2.4 蛋白印跡法檢測異夏佛塔苷對A549細胞凋亡相關(guān)基因Bax、Bcl-2和Caspase-3表達的影響 取不同濃度的異夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)作用于A549細胞48h，0.25%的胰酶消化A549細胞并收集細胞，加入60μLRIPA細胞裂解液，懸浮細胞，避光冰浴30min，12000rpm×30min離心細胞，吸取上清液，并以BCA法進行蛋白定量，SDS-PAGE電泳蛋白樣品后，轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1h，封一抗過夜，TBST漂洗3次后，二抗室溫孵育2h，后曝光顯影。后續(xù)進行二抗孵育2h、漂洗、顯色以及曝光反應，最終確定不同濃度的異夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)對A549細胞凋亡相關(guān)因子表達的影響[7]。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以“均數(shù)±標準差”表示，采用t檢驗P<0.05為有統(tǒng)計學差異,P<0.01為有顯著統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 異夏佛塔苷對A549細胞株的增殖抑制作用異夏佛塔苷在5.0～20μmol/L濃度范圍內(nèi)對A549細胞具有明顯的抑制作用，且隨著異夏佛塔苷濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用依次增強，符合時間和劑量依賴性，且中、高劑量組作用72h基本上不存在活細胞。與空白對照組相比，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。詳見圖1。

圖1 異夏佛塔苷對A549細胞增殖抑制的影響

2.2 異夏佛塔苷對A549細胞凋亡的影響結(jié)果顯示：與空白對照組相比，隨著異夏佛塔苷濃度的增高，作用于A549細胞48h后細胞凋亡率逐漸增高(分別為：15.3%、23.1%、31.4%)說明異夏佛塔苷可誘導A549細胞凋亡,呈現(xiàn)劑量依賴性。詳見圖2。

圖2 異夏佛塔苷對A549細胞凋亡的影響

2.3 異夏佛塔苷對A549細胞凋亡相關(guān)因子表達的影響結(jié)果顯示：與空白對照組相比，不同濃度的異夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)作用于A549細胞48h后，隨著異夏佛塔苷濃度的增加，Caspase-3、Bax表達量依次增加，Bcl-2表達量依次降低，且具有劑量依賴性。詳見圖3。

圖3 異夏佛塔苷對A549細胞凋亡相關(guān)基因表達的影響

3 討論

在抗腫瘤藥物研發(fā)中，中藥因其具有的多途徑、多靶點、毒性小等優(yōu)勢受到科研工作者越來越多的關(guān)注。

天南星是一味傳統(tǒng)中藥材，在我國已有兩千多年的用藥歷史。近年來，一些基礎(chǔ)和臨床實驗表明天南星在治療腫瘤方面有較好療效，引起了國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。天南星的抗腫瘤作用與其黃酮類成分相關(guān)，而異夏佛塔苷是其黃酮類主要成分之一，因此，我們圍繞異夏佛塔苷開展了抗腫瘤的體外實驗研究。

本實驗中我們觀察了不同濃度異夏佛塔苷對人非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響。MTT結(jié)果表明，異夏佛塔苷對A549細胞增殖具有抑制作用，且有明顯時間和劑量依賴性。我們通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，Annexin-V/PI雙染結(jié)果表明：與對照組相比，不同濃度的異夏佛塔苷(5μM、10μM、20μM)作用于A549細胞48h后可以引起A549細胞凋亡率明顯增加，有劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義。研究表明，Bcl-2是細胞凋亡通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在腫瘤細胞中均呈現(xiàn)高表達，可以通過抑制Bax轉(zhuǎn)位進入線粒體，進而下調(diào)Capsase-3的表達，最終導致腫瘤細胞的凋亡[8-10]。為進一步探討異夏佛塔苷誘導A549細胞凋亡的可能機制，我們檢測了被異夏佛塔苷處理過的A549細胞中Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達，Western blot結(jié)果顯示：異夏佛塔苷可增加A549細胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達，降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表達。

綜上所述，本實驗結(jié)果表明：異夏佛塔苷可有效抑制人非小細胞肺癌A549細胞增殖，通過促進Bax表達，抑制Bcl-2表達進而激活Caspase-3，最終誘導A549細胞的凋亡，在抗腫瘤方面具有重要意義與研究價值。

本項目的研究為明確中藥天南星有效化學成分與藥理作用之間的相關(guān)性，進一步開發(fā)和利用天南星藥用資源提供實驗依據(jù)。