circPVT1與lncGAS5在乳腺癌中的表達(dá)

張?chǎng)┉?，金春明，尹貴彬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 牡丹江 157011)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響女性的身心健康[1]。我國(guó)并不是乳腺癌的高發(fā)國(guó)家，但近幾年我國(guó)乳腺癌發(fā)病率的增長(zhǎng)速度逐漸超過許多高發(fā)國(guó)家[2]。有研究表明，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率正以每年2%左右的速度遞增[3]，特別對(duì)于城市女性，乳腺癌所致的疾病負(fù)擔(dān)日益加重[4]。乳腺癌早期沒有明顯的癥狀和體征，當(dāng)患者出現(xiàn)明顯的臨床表現(xiàn)時(shí)已經(jīng)處于乳腺癌的中期或晚期，因此往往會(huì)錯(cuò)過乳腺癌的最佳治療時(shí)期。所以，研究乳腺癌相關(guān)的分子生物標(biāo)志物對(duì)于乳腺癌的早期診斷與治療具有重要意義。近年來，隨著對(duì)非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)的研究，環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)也逐漸出現(xiàn)在人們的視野之中。CircRNA是一種特殊的ncRNA，與線性RNA不同的是，它沒有5′端帽子結(jié)構(gòu)，也沒有3′端多聚A尾結(jié)構(gòu)，而是5′端與3′端直接相連形成一種閉合環(huán)狀的特殊結(jié)構(gòu)[5]。由于circRNA有其特殊的廣泛性，穩(wěn)定性，保守性等特征并存在于真核生物細(xì)胞質(zhì)中，有望成為腫瘤早期診斷的分子生物標(biāo)志物。有研究表明circPVT1在許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中都起著重要作用，但關(guān)于circPVT1在乳腺癌中的表達(dá)的報(bào)道比較少見。而lncRNA也有報(bào)道顯示在一些腫瘤中可作為新的分子生物標(biāo)記物和潛在治療靶點(diǎn)，其中l(wèi)ncGAS5在癌癥中起著抑癌作用。本研究是為了探討circPVT1與lncGAS5及其比值在乳腺癌中的表達(dá)及評(píng)估，為乳腺癌的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年1月至2019年7月在牡丹江腫瘤醫(yī)院治療的60例乳腺癌患者中乳腺癌組織、癌旁組織及其相應(yīng)血清樣本和牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院60例體檢中心正常女性的對(duì)照血清樣本。所有乳腺癌患者均通過病理確診為原發(fā)性乳腺癌，均為女性，年齡在35～80歲，平均(53.6±10.2)歲。根據(jù)AJCC分期，Ⅰ期患者14例，Ⅱ期患者31例，Ⅲ期患者9例，Ⅳ期患者6例。所有患者術(shù)前均未經(jīng)放化療治療。

1.2 主要試劑與儀器Trizol RNA 提取試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，Master Mix試劑盒購(gòu)于德國(guó)Roche公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABIQ6)購(gòu)于美國(guó)APPlied Biosystem Inc 公司，PCR引物購(gòu)于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織中circPVT1與lncGAS5水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)組織circPVT1與lncGAS5表達(dá)情況。①標(biāo)本收集與保存：收集乳腺癌癌組織與相應(yīng)的癌旁正常組織于EP管中，并保存于-80℃冰箱中備用；②Trizol法提取組織中總RNA；③用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA；④qRT-PCR檢測(cè)：采用qRT-PCR儀對(duì)circPVT與lncGAS5進(jìn)行擴(kuò)增，以β-Actin為內(nèi)參。反應(yīng)體系：正、反引物(10μmol/L)各0.5μL,2×Master Mix5.0μL，cDNA(50 ng/μL)1.0μL，qRT-PCR試劑盒中水2.0μL，共9μL。反應(yīng)條件設(shè)置如下：95℃10min，95℃15s，60℃60s，共45各循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，采用 2-ΔΔCT法對(duì)circPVT1和lncGAS5在樣本中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析。

1.3.2 血清中circPVT與lncGAS5水平檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)血清circPVT1與lncGAS5表達(dá)情況。①標(biāo)本收集與保存：抽取外周靜脈血3mL，3000r/min離心10min，保留上清液與EP管中，并保存與-80℃冰箱中備用；②Trizol法提取血清中總RNA；③從用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA至qRT-PCR檢測(cè)全部步驟同“1.3.1”。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)和GraPhPad Prism進(jìn)行圖像繪制。計(jì)量資料用中位數(shù)(M)及四分位間距(QR)表示,組間比較采用配對(duì)的非參數(shù)檢驗(yàn)，兩個(gè)獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon W非參數(shù)檢驗(yàn)和多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis非參數(shù)檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁組織中circPVT1與lncGAS5水平circPVT1在乳腺癌組織中的表達(dá)量高于癌旁組織；lncGAS5的表達(dá)量在乳腺癌組織中處于低表達(dá)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖1、圖2。

圖1 乳腺癌組織與癌旁組織中circPVT1水平比較

注：Breast cancer tissue：乳腺癌組織；Paracancerous：癌旁組織；Relative circPVT1 expression：circPVT1水平比較

圖2 乳腺癌組織與癌旁組織中l(wèi)ncGAS5水平比較

注：Breast cancer tissue：乳腺癌組織；Paracancerous：癌旁組織；Relative lncGAS5 expression：lncGAS5水平比較

2.2 乳腺癌患者血清與健康對(duì)照者血清中circPVT1與lncGAS5水平circPVT1在乳腺癌血清中的表達(dá)量高于健康對(duì)照血清；GAS5的表達(dá)量在乳腺癌血清中處于低表達(dá)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3、圖4。

圖3 乳腺癌患者血清和健康對(duì)照者血清中circPVT1水平比較

注：Breast cancer serum：乳腺癌血清；Normal serum：健康對(duì)照血清；Relative circPVT1 expression：circPVT1水平比較

圖4 乳腺癌患者血清和健康對(duì)照者血清中l(wèi)ncGAS5水平比較

注：Breast cancer serum：乳腺癌血清；Normal serum：健康對(duì)照血清；Relative lncGAS5 expression：lncGAS5水平比較

2.3 各期乳腺癌患者circPVT1/lncGAS5的水平circPVT1與GAS5的比率與乳腺癌的分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),見圖5。

圖5 circPVT1/lncGAS5在乳腺癌不同分期的表達(dá)量

注：ratio of circpvt1/lncGAS5：circPVT1/lncGAS5的表達(dá)量

2.4 乳腺癌組織中circPVT1與lncGAS5與乳腺癌臨床病理特征關(guān)系淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移中circPVT1表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、AJCC不同分期中l(wèi)ncGAS5的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；circPVT1與lncGAS5與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小和腫瘤的部位無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

表2 組織中circPVT1、lncGAS5與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)在RNA研究中的應(yīng)用與發(fā)展，已有大量的circRNA與lncRNA被人們所認(rèn)識(shí)，但對(duì)于circRNA與lncRNA的作用機(jī)制還不是特別明確，進(jìn)一步的研究還屬于起步階段。

本文探討的circPVT1是由PVT1基因的初始轉(zhuǎn)錄本中的一個(gè)外顯子環(huán)化形成的一種circRNA，位于染色體8q24上擁有癌癥易感位點(diǎn)和兩個(gè)內(nèi)含子側(cè)翼(35269bP和41466bP)，還包括許多Alu重復(fù)序列[6]。Panda[7]等人發(fā)現(xiàn)circPVT1是一個(gè)與衰老相關(guān)的circRNA，在人二倍體WI-38細(xì)胞中呈低表達(dá)并通過調(diào)控let-7影響靶基因來抑制衰老。Chen[8]等人在研究胃癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織中發(fā)現(xiàn)，circPVT1在胃癌組織中呈高表達(dá)并且還用過分子海綿作用miRNA-125家族來促進(jìn)細(xì)胞的增殖。circPVT1的水平被認(rèn)為是一個(gè)在胃癌中獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。也可以說circPVT1是胃癌中的一種新的增殖因子和預(yù)后標(biāo)志物。但是circPVT1在乳腺癌中的關(guān)聯(lián)還沒有相關(guān)報(bào)道顯示，本研究結(jié)果顯示circPVT1在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)。生長(zhǎng)阻滯特異轉(zhuǎn)錄本 5(GAS5)是一種抑癌基因，該基因編碼的染色體位點(diǎn)是1q25。Mourtada 等[9]發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織標(biāo)本中 lncGAS5 水平顯著低于正常乳腺上皮組織，同時(shí)，lncGAS5 的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞的增殖呈負(fù)相關(guān)。還有研究表明lncGAS5 過表達(dá)還可增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但對(duì)于circRNA與linRNA在乳腺癌中的聯(lián)合檢測(cè)和兩者之間的比值在乳腺癌中的表達(dá)還沒有相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，lncGAS5在乳腺癌中呈低表達(dá)，并且circPVT1與lncGAS5的比值與乳腺癌的分期呈正相關(guān)。

CircRNA從最開始被人們認(rèn)為是“垃圾分子”，到如今被證實(shí)廣泛存在真核生物中，并逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，這個(gè)過程是漫長(zhǎng)的。但由于circRNA有其特殊的廣泛性，穩(wěn)定性，保守性等特征也因此吸引了更多研究者對(duì)它進(jìn)行研究。大量研究表明，circRNA在肝癌[10]、乳腺癌[11-13]、胃癌、肺癌等的發(fā)展進(jìn)程中有著一定的作用。還有研究報(bào)道，linRNA在乳腺癌[14-21]的預(yù)防、診斷、治療等方面也具有廣闊的應(yīng)用前景。但是linRNA作為生物標(biāo)記物或是新的腫瘤治療手段仍然沒有得到更加廣泛的應(yīng)用，其中巨大的挑戰(zhàn)是準(zhǔn)確尋找臨床治療的靶點(diǎn)及其目標(biāo)基因，并能全面了解它們的相互作用。為此，更加先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)、更加完善的體外體內(nèi)試驗(yàn)應(yīng)該更多地應(yīng)用于乳腺癌等腫瘤相關(guān)linRNA的基礎(chǔ)和臨床研究中，從而找出更多與乳腺癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移、耐藥相關(guān)的linRNA，深入了解其靶基因和相關(guān)作用機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)特異的治療藥物，實(shí)現(xiàn)有效殺滅腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤的復(fù)發(fā)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性等目標(biāo)。

綜上所述，circPVT1與lncGAS5及其比值在乳腺癌中的輔助診斷是有價(jià)值的，有望成為乳腺癌早期診斷的潛在分子生物標(biāo)志物。