線粒體核糖體蛋白L13在肺腺癌中的表達及意義

馬 娜，劉 芳

(佛山市第一人民醫(yī)院病理科，廣東 佛山 528000)

肺癌是世界第一大腫瘤，也是腫瘤相關(guān)致死率最高的腫瘤。2018年，肺癌新發(fā)病例約210萬，死亡病例約180萬[1]。腺癌是肺部腫瘤最常見的類型，約占肺部腫瘤總數(shù)的40%。肺腺癌(Lung Adenocarcinoma，LUAD)最重要的風險因素是吸煙。外科手術(shù)是肺癌最常見的治療方法，但預(yù)后情況仍不佳。因此，研究肺腺癌的發(fā)病分子機制將有助于肺腺癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)防。

多項研究發(fā)現(xiàn)線粒體功能異?；蛘系K可引起多種疾病。根據(jù)不同的組織、器官對線粒體的依賴程度而產(chǎn)生不同組織特異性表現(xiàn)，比如腫瘤、心血管疾病、聽力障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、發(fā)育障礙性疾病、感覺障礙性疾病、代謝障礙性疾病等[2-5]。線粒體是制造細胞所需能量的細胞器，在細胞能量代謝過程中起到關(guān)鍵作用。線粒體核糖體蛋白(mitochondrial ribosomal proteins，MRPs)存在于真核細胞線粒體內(nèi)，在胞漿內(nèi)合成后，從細胞質(zhì)基質(zhì)中運送到線粒體內(nèi)以完成線粒體核糖體的裝配，參與線粒體蛋白的翻譯過程[6]。線粒體核糖體是已知發(fā)現(xiàn)沉降系數(shù)最小的核糖體，其沉降系數(shù)約55～60S，由28S小亞基和39S大亞基組成。國際上根據(jù)MRP電泳特性不同命名。線粒體核糖體蛋白除了參與合成線粒體蛋白和制造能量，還參與多種細胞生命活動，包括線粒體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、細胞分化、細胞信息傳遞和細胞凋亡等過程，MRPs在多種惡性腫瘤中的表達出現(xiàn)異常[7]。

線粒體功能異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。目前已發(fā)現(xiàn)多種MRPs在腫瘤中表達升高。例如RPL5、RPL11、RPL13可通過抑制MDM2/HDM2蛋白激活P53通路阻滯細胞周期[8-12]。DD-MRP4及MRPL41通過穩(wěn)定p53蛋白抑制腫瘤細胞增殖[13-14]。MRPS7、MRPS15、MRPS22、MRPL40在乳腺癌中高表達[15]；MRPS23在宮頸癌中高表達[16]；膀胱癌組織中MRPS5高表達[17]；MRPS29在甲狀腺癌[18]；MRPS35在睪丸生殖細胞腫瘤中高表達；MRPL11在頭頸鱗狀細胞癌中高表達[19-20]。目前已證實mrps18B是致癌基因，MRPS18B在子宮內(nèi)膜癌中高表達，在子宮內(nèi)膜癌細胞系中過表達，MRPS18B可增強其增殖能力。MRPL35在食管癌中高表達，通過慢病毒載體介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)，沉默MRPL35可明顯抑制食管癌細胞TE-1的增殖能力，并促進TE-1細胞的凋亡[21]。

癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫是一個多組學(xué)的數(shù)據(jù)庫，包含多種癌癥的基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、表觀遺傳組數(shù)據(jù)及其關(guān)聯(lián)的臨床數(shù)據(jù)，為腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等研究提供了大量的數(shù)據(jù)。本研究利用TCGA公共數(shù)據(jù)庫及多種在線分析軟件，從mRNA及蛋白水平分析MRPL13在肺腺癌中的表達情況、MRPL13在肺腺癌組織中的表達對預(yù)后的影響，探討MRPL13在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料和方法

1.1 資料數(shù)據(jù)來源數(shù)據(jù)均來源于TCGA數(shù)據(jù)庫，包括肺腺癌數(shù)據(jù)集的mRNA表達數(shù)據(jù)以及對應(yīng)的臨床資料數(shù)據(jù)。臨床資料包括生存時間、生存狀態(tài)、年齡、疾病分期等。

1.2 基因表達分析利用GEPIA對TCGA數(shù)據(jù)進行分析，共分析483例肺腺癌組織及50例癌旁組織、不同分期肺腺癌組織中MRPL13的mRNA表達水平。

1.3 肺癌組織MRPL13免疫組化染色通過The Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫獲取肺腺癌組織的免疫組化染色結(jié)果。

1.4 生存分析利用The Human Protein Atlas對TCGA數(shù)據(jù)進行分析，獲得生存資料完整的500例臨床數(shù)據(jù)進行生存分析并計算MRPL13 mRNA表達量最佳截斷值(兩組生存率差別最大時基因表達量FPKM的值，即cutoff值)，并依據(jù)最佳截斷值將樣本分為高表達組和低表達組。

1.5 統(tǒng)計分析肺腺癌組織與癌旁組織的MRPL13表達量比較用單因素方差分析。不同分期肺腺癌組織的MRPL13采用F檢驗分析。生存分析采用Log-rank檢驗分析，運用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁組織中MRPL13 mRNA的表達與癌旁組織相比，肺腺癌組織高表達MRPL13 mRNA。提示肺腺癌的發(fā)生過程中MRPL13表達升高，見圖1。

圖1 MRPL13 mRNA在癌組織和癌旁組織的表達水平

2.2 不同臨床分期患者肺MRPL13 mRNA的表達肺腺癌I期的腫瘤組織MRPL13表達量最低，IV期的表達量最高(P=0.0287)，提示MRPL13表達水平與肺腺癌進展相關(guān)，見圖2。

圖2 MRPL13 mRNA在不同肺腺癌不同分期癌組織中的表達水平

2.3 肺癌組織MRPL13蛋白免疫組化染色與癌旁組織相比，肺腺癌組織高表達MRPL13蛋白，與mRNA結(jié)果一致，肺間質(zhì)不表達或低表達MRPL13蛋白。此外MRPL13蛋白主要在胞質(zhì)中表達，見圖3。

圖3 免疫組化檢測MRPL13蛋白在肺腺癌中的表達

2.4 MRPL13表達量對肺腺癌預(yù)后的影響The Human Protein Atlas對TCGA數(shù)據(jù)進行分析后可自動得出MRPL13基因在肺腺癌組織表達中位數(shù)為7.86，cutoff值為7.02，因此將MRPL13表達≥7.02定義為高表達組(n=294)，<7.02定義為低表達組(n=206)。MRPL13表達與總體生存顯著相關(guān)，高表達患者總體生存期明顯低于低表達患者(P<0.001)。MRPL13高表達組患者5年生存率僅為33%，低表達組5年生存率為52%。MRPL13高表達組患者15年生存率僅為0%，低表達組15年生存率為46%。MRPL13高表達組患者預(yù)后明顯差于MRPL13低表達組患者，見圖4。

圖4 MRPL13表達量與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

目前，肺癌的治療有了較大進展，但耐藥仍是化療中的一個主要瓶頸。雖然新型化療藥不斷出現(xiàn)，但部分肺癌患者對化療依然不敏感。因此迫切需要發(fā)現(xiàn)新的診斷及治療靶點。得益于近年來高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們可以通過各種技術(shù)手段高效的分析腫瘤相關(guān)差異基因的表達、甲基化等數(shù)據(jù)。

線粒體功能異常引起疾病呈現(xiàn)增多的趨勢以及腫瘤依然是人類健康的主要威脅，越來越多的研究者開始關(guān)注線粒體功能異常與腫瘤的關(guān)系。由于MRPs參與線粒體核糖體組裝和翻譯，因此是合成線粒體蛋白和制造能量的關(guān)鍵分子。

多項研究表明，MRPs在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，并可作為腫瘤預(yù)后標志物和治療靶點。此外MRPs還和臨床病理特征相關(guān)，比如腫瘤亞型、分期、侵襲等。肺腺癌和MRPL13的相關(guān)性研究較少。有研究顯示MRPS22的表達與非小型細胞肺癌的病理亞型有關(guān)，78%的鱗狀細胞癌和腺癌高表達MRPS22，在其他類型肺癌中不表達或低表達MRPS22[22]，不過遺憾的是該研究并未分析MRPS22與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性以及不同分期肺癌組織中MRPS22的水平。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫及多種在線分析工具從mRNA、蛋白水平分析肺腺癌組織與癌旁組織中MRPL13的表達水平、不同肺腺癌分期MRPL13 mRNA的表達水平、MRPL13 mRNA與患者預(yù)后的相關(guān)性?；虮磉_譜結(jié)果顯示與癌旁組織相比，肺腺癌組織高表達MRPL13 mRNA(圖1)，提示肺腺癌的發(fā)生過程中MRPL13表達升高。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示與癌旁組織相比，肺腺癌組織高表達MRPL13蛋白，與mRNA結(jié)果一致，肺間質(zhì)不表達或低表達MRPL13蛋白。此外MRPL13蛋白主要在胞質(zhì)中表達(圖3)。肺腺癌I期的腫瘤組織MRPL13表達量最低，IV期的表達量最高(P=0.0287)(圖2)，提示MRPL13表達水平與肺腺癌進展相關(guān)。MRPL13表達與總體生存顯著相關(guān)，高表達患者總體生存期明顯低于低表達患者(P<0.001)。MRPL13高表達組患者5年生存率僅為33%，低表達組5年生存率為52%。MRPL13高表達組患者15年生存率僅為0%，低表達組15年生存率為46%。MRPL13高表達組患者預(yù)后明顯差于MRPL13低表達組患者(圖4)。綜上所述，MRPL13是促進肺腺癌進展的重要分子之一，MRPL13可作為肺腺癌預(yù)后的指標之一，MRPL13也可能作為肺腺癌治療的靶點。本實驗中由于配對癌組織和癌旁組織的數(shù)量有限，可能統(tǒng)計上會有偏差，因此我們需要進一步收集數(shù)據(jù)，甚至在本單位收集腫瘤樣本擴大樣本量并進行測序分析。此外，本研究缺乏敲除或過表達MRPL13對肺腺癌腫瘤細胞影響的數(shù)據(jù)。MRPL13 在肺腺癌進展過程中發(fā)揮的分子機制暫不清楚，需要進一步的研究。解析MRPL13 在肺腺癌進展過程中發(fā)揮的分子機制可為肺腺癌的診斷和治療提供新的思路。