熒光定量PCR法檢測(cè)外周血LUNX mRNA表達(dá)與肺癌微轉(zhuǎn)移的關(guān)系

喻朝澤暄

(中國(guó)人民解放軍第404醫(yī)院，山東 威海 264200)

肺癌不僅是目前患病率以及致死率最高的惡性腫瘤之一，還具有患者預(yù)后差、遠(yuǎn)期生存率較低等特點(diǎn)[1]，即使在其早期發(fā)現(xiàn)并給予手術(shù)切除治療，患者生存率仍較低。有研究顯示Ⅰ期部分無(wú)明顯腫瘤擴(kuò)散跡象的肺癌患者在治療后仍會(huì)因復(fù)發(fā)死亡[2]。因此，早期診斷肺癌是否轉(zhuǎn)移，及時(shí)制定針對(duì)性的治療方案，對(duì)提高NSCLC患者的遠(yuǎn)期生存率、改善預(yù)后和生存時(shí)間具有重要意義。LUNX是通過(guò)mRNA差異顯示技術(shù)分離得到的肺組織特異性基因[3]，楊斌[4]等人發(fā)現(xiàn)以LUNX mRNA作為標(biāo)記物檢測(cè)NSCLC患者淋巴結(jié)和外周血微轉(zhuǎn)移具有較高的靈敏度和特異度。本研究采用熒光定量PCR(FQ PCR)法檢測(cè)外周血LUNX mRNA表達(dá)，旨在進(jìn)一步研究其表達(dá)與肺癌微轉(zhuǎn)移的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇本院2012年3月至2017年8月診治的225例NSCLC患者作為研究組，所有患者均經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診為肺癌，其中男165例，女60例；年齡40～70歲，平均(53.43±5.15)歲；疾病類(lèi)型：腺癌110例，鱗癌115例；疾病分期：Ⅰ期45例；Ⅱ期50例；Ⅲ期100例；Ⅳ期30例。選擇同期診治的肺部良性病變患者30例作為對(duì)照組，其中男22例，女8例；年齡40～75歲，平均(54.05±5.23)歲；疾病類(lèi)型：肺結(jié)核10例，炎性假瘤8例，其他12例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除合并其他腫瘤者。兩組年齡、性別相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

1.2 方法儀器與試劑：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Trizol試劑、淋巴細(xì)胞分離液、Ex Taq酶、熒光定量PCR儀等均購(gòu)自Invitrogen公司。

總RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄：分別抽取A組、B組患者治療前以及對(duì)照組靜脈血5mL，采用淋巴細(xì)胞分離液分離有核細(xì)胞，離心分離，取上清液置于無(wú)菌管中，加入1000μL Trizol試劑以及適量氯仿、異丙醇沉淀總RNA，并通過(guò)75%乙醇、無(wú)菌水溶解RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或者低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

引物設(shè)計(jì)：目的基因Lunx，上游引物為5＇-TCATTGTCTTCTACGGGCTGTT-3＇，下游引物5＇-CTTGGAGCTTTATGCCGAGAG-3＇，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為402 bp；內(nèi)參基因GAPDH，上游引物為5＇-GGATTTGGTCGTATTGGG-3＇，下游引物為5＇-GGAAGATGGTGATGGGATT-3＇，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為205 bp。

FQ PCR反應(yīng)：擴(kuò)增所有外周血標(biāo)本的LUNX和GAPDH，每個(gè)反應(yīng)終體積為25μL，設(shè)置PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5min，嚴(yán)格按照儀器使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每次擴(kuò)增均設(shè)無(wú)模板對(duì)照。

以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為基礎(chǔ)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算起始模板拷貝數(shù)，采用同一樣本中目的基因拷貝數(shù)與內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值表示樣本LUNX mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3 評(píng)估指標(biāo)比較研究組與對(duì)照組、不同分期以及不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的NSCLC患者的外周血LUNX mRNA表達(dá)陽(yáng)性率，同時(shí)對(duì)225例NSCLC患者隨訪1～24個(gè)月(期間無(wú)失訪人員)，比較LUNX mRNA表達(dá)陽(yáng)性和陰性患者的2年生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以n(%)表示，行卡方檢驗(yàn)；生存資料采用Kaplan-Meier法，生存率以百分比表示、中位生存時(shí)間以中位數(shù)表示；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者外周血LUNX mRNA表達(dá)比較研究組患者LUNX mRNA表達(dá)陽(yáng)性率為73.33%，明顯高于對(duì)照組的10.00%(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者LUNX mRNA表達(dá)對(duì)比[n(%)]

2.2 NSCLC不同分期患者外周血LUNX mRNA表達(dá)比較疾病分期高的患者表達(dá)陽(yáng)性率高，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者陽(yáng)性率分別為60.00%、85.00%、100.00%，明顯高于Ⅰ期患者的44.44%(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同分期患者LUNX mRNA表達(dá)對(duì)比[n(%)]

2.3 NSCLC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況與其外周血微轉(zhuǎn)移陽(yáng)性率的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陽(yáng)性患者的LUNX mRNA表達(dá)陽(yáng)性率為88.89%，明顯高于淋巴結(jié)陰性患者的50.00%(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同淋巴結(jié)情況患者LUNX mRNA表達(dá)對(duì)比[n(%)]

2.4 不同外周血LUNX表達(dá)的NSCLC患者遠(yuǎn)期生存率比較外周血LUNX表達(dá)陽(yáng)性(組別1)患者2年生存率為21.21%(35/165)，中位生存時(shí)間為14.27個(gè)月；外周血LUNX表達(dá)陰性(組別2)患者2年生存率為66.67%(40/60)，中位生存時(shí)間為23.84個(gè)月，陽(yáng)性患者2年生存率明顯低于陰性患者(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

肺癌微轉(zhuǎn)移主要是指在腫瘤細(xì)胞在發(fā)展過(guò)程中擴(kuò)散至血液、淋巴、骨髓以及各組織器官中，并較好的存活下來(lái)，但并沒(méi)有形成明顯的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，患者無(wú)任何臨床表現(xiàn)，同時(shí)在CT等影像學(xué)技術(shù)、病理學(xué)檢查等檢測(cè)也難以發(fā)現(xiàn)的一種微量轉(zhuǎn)移[5]。微轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的基礎(chǔ)階段，病灶的轉(zhuǎn)移會(huì)受細(xì)胞自身特點(diǎn)、患者自身免疫以及局部血供等影響，但大量研究證實(shí)在外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞往往表明轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)性增加[6]，因此，快速有效的檢測(cè)方法十分必要。

血液擴(kuò)散是導(dǎo)致肺癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要原因，有研究顯示LUNX在其他腫瘤組織中表達(dá)甚少，但在NSCLC以及正常肺組織中的表達(dá)具有較高的特異性，尤其是肺癌組織[7]。同時(shí)健康人外周血細(xì)胞中含有RNA裂解酶，mRNA難以完整存在，致使LUNX通常無(wú)表達(dá)[8]。因此，在外周血中檢測(cè)到LUNX mRNA表達(dá)即表明存在肺癌微轉(zhuǎn)移。FQ PCR檢測(cè)方法是一種具有污染率低、操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確率高的核酸定量技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于臨床[9]。本研究通過(guò)對(duì)NSCLC以及肺部良性病變患者的外周血進(jìn)行FQ PCR檢查，結(jié)果顯示NSCLC患者LUNX mRNA表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于良性病變患者，與陸薇[10]等人研究相符，進(jìn)一步表明LUNX對(duì)于肺癌組織細(xì)胞的高敏感度和高特異度，可作為診斷肺癌微轉(zhuǎn)移的標(biāo)記物。同時(shí)進(jìn)行疾病分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較，發(fā)現(xiàn)Ⅲ、Ⅳ期患者以及淋巴結(jié)陽(yáng)性患者表達(dá)陽(yáng)性率明顯較高，提示不同疾病分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況與肺癌微轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。此外，本研究還針對(duì)不同LUNX表達(dá)患者進(jìn)行隨訪調(diào)查，結(jié)果顯示LUNX表達(dá)陽(yáng)性患者2年生存率明顯低于陰性患者，其2年生存時(shí)間較短，提示外周血檢測(cè)LUNX mRNA表達(dá)對(duì)于NSCLC患者預(yù)后具有重要參考價(jià)值，陽(yáng)性患者轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的可能性更高，預(yù)后更差；同時(shí)表明NSCLC患者外周血中的LUNX表達(dá)可能來(lái)源于轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞，其較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移傾向也解釋了部分早期NSCLC患者即使無(wú)任何轉(zhuǎn)移跡象，在手術(shù)治療后仍然出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)現(xiàn)象的原因。

綜上所述，F(xiàn)Q PCR檢測(cè)外周血LUNX mRNA表達(dá)可作為肺癌微轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，對(duì)早期診斷微轉(zhuǎn)移以及評(píng)估患者預(yù)后、制定針對(duì)性的治療方案具有重要指導(dǎo)作用。但由于明顯的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移還受機(jī)體免疫等其他因素影響，因此，在外周血中檢測(cè)到LUNX表達(dá)并不意味著一定會(huì)形成顯性轉(zhuǎn)移，因此，還需進(jìn)一步做深入研究。