敲減BMI1對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

郭 楠，王慶瑋，羅賢臣，倪觀太

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院婦產(chǎn)科，安徽 蕪湖 241001)

子宮頸癌是女性常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，在全世界女性惡性腫瘤中發(fā)病率排第3[1]，在我國(guó)每年有9.89萬(wàn)左右的新增加的宮頸癌病例數(shù)，且近些年有越來(lái)越多的年輕女性罹患宮頸癌。手術(shù)、放療、化療在治療宮頸癌中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，然而這些方法帶來(lái)的相關(guān)副作用決定了其仍然存在一定的局限性。早期宮頸癌經(jīng)治療后5年生存率較高，但晚期宮頸癌患者的預(yù)后以及生活質(zhì)量仍不理想，這嚴(yán)重威脅了全球女性的身心健康。故深人探索宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找宮頸癌獲得早期治療的新靶點(diǎn)十分重要。

B細(xì)胞特異性莫洛尼小鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1(B-cell-specific moloney leukemia virus insert site 1,BMI1)基因編碼無(wú)名指蛋白，其位于10號(hào)染色體上[2]，是一種通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)介導(dǎo)基因沉默的聚梳抑制因子復(fù)合物1(Prc 1)的成員[3-4]。它是神經(jīng)干細(xì)胞自我修復(fù)和神經(jīng)祖細(xì)胞在成體組織內(nèi)增殖的有力誘導(dǎo)劑[5]，調(diào)控多種疾病過(guò)程，對(duì)細(xì)胞增殖、分化、自我更新和對(duì)多種抗癌藥物的耐藥等方面發(fā)揮著重要作用。本研究通過(guò)在宮頸癌HeLa細(xì)胞系敲減BMI1基因后進(jìn)行體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，研究敲減BMI1后對(duì)于宮頸癌細(xì)胞的各種基本生物功能產(chǎn)生的影響，以判斷是否可作為宮頸癌治療及預(yù)后判斷的新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集于皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院婦科收集正常新鮮宮頸組織及宮頸癌組織各10例。所有組織標(biāo)本均在離體后盡快置于-80℃冰柜中保存。宮頸癌患者年齡39～64歲，平均(46.8±7.2)歲，對(duì)照組的年齡在44～65歲，平均為(53.0±7.8)歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性宮頸癌患者；②術(shù)前無(wú)激素治療、放射治療或化療的病史；③所有患者均經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬弋磯山醫(yī)院病理科證實(shí)；④對(duì)照組選擇同病例對(duì)照或同期經(jīng)檢查無(wú)癌癥的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他癌癥；②經(jīng)過(guò)治療的患者。

1.2 細(xì)胞與試劑從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)入人宮頸癌HeLa細(xì)胞株。1640培養(yǎng)基、胎牛血清從賽默飛世爾公司購(gòu)買。cDNA試劑盒及qPCR試劑盒于天根公司購(gòu)買，引物、轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于銳博公司。Transwell小室于康寧公司購(gòu)買。Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自碧迪公司，CCK-8、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于貝博公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與siBMI1轉(zhuǎn)染將HeLa細(xì)胞接種于1640培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清，在溫度37 ℃、飽和濕度及5%CO2的培養(yǎng)箱中繁育，適當(dāng)換液及傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞，按每孔2～3×105細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)30%～50%時(shí)，分別用siBMI1及siNC轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)將收集的宮頸正常組織及宮頸癌組織充分研磨，利用Trizol試劑按照說(shuō)明書(shū)提取總RNA，選擇那些經(jīng)證實(shí)完整性較好的RNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。并利用ABI7500實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)BMI1 mRNA的表達(dá)量。SYBR Green反應(yīng)體系為20μL。利用2- △△Ct法計(jì)算BMI1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 CCK8實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的 HeLa 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，后以每孔3×103細(xì)胞數(shù)種植到96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。0、24、48、72h后每孔分別加入10μLCCK8試劑，培養(yǎng)箱孵育3h后，酶標(biāo)儀450nm的波長(zhǎng)范圍檢測(cè)光密度值(OD值)。重復(fù)檢測(cè)3次，檢測(cè)敲減BMI1后細(xì)胞的增殖能力有何變化。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染24 h后分別收集兩組細(xì)胞，以每孔5×105細(xì)胞數(shù)種植于6孔板，待其幾乎長(zhǎng)滿時(shí)，用10μL槍頭在6孔板內(nèi)垂直畫(huà)線，2遍PBS洗滌后加入低血清1640培養(yǎng)基，24 h后于倒置的顯微鏡下觀察拍照。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)取出24孔板，將Matrigel基質(zhì)膠按說(shuō)明書(shū)稀釋后平鋪入Transwell小室，將500μL含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基緩慢加入下室，玻璃管收集siBMI1轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，以無(wú)血清1640培養(yǎng)基重懸，每孔5×105/mL的細(xì)胞懸液200μL接種于小室上室。24h后，沾有少量PBS的棉簽擦拭Transwell小室膜的上層，4%多聚甲醛固定30min，0.1%結(jié)晶紫染料染色20min，蒸餾水沖洗數(shù)次。于倒置顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)出Transwell小室被結(jié)晶紫染色的細(xì)胞數(shù)目，即代表穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)目的多少，以此說(shuō)明侵襲能力高低。各樣本均選擇相對(duì)平均的5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)出各細(xì)胞個(gè)數(shù)，最后得出平均值。

1.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)分別收集兩組細(xì)胞，加入5μL Annexin V-FITC，4℃，避光孵育15min，接著加入5μL PI，4℃，再次避光孵育5min。上機(jī)，流式細(xì)胞儀分別測(cè)出兩組細(xì)胞的凋亡率。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)分析?！熬鶖?shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示計(jì)量資料，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和卡方檢驗(yàn)。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMI1在宮頸癌組織中表達(dá)增高qRT-PCR結(jié)果表明與正常宮頸組織相比，BMI1 mRNA在宮頸癌組織中表達(dá)量增高明顯(P<0.05)。(圖1)。

圖1 BMI1在正常宮頸組織及宮頸癌組織中的表達(dá)(P<0.05)

2.2 敲減BMI1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證敲減效率，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后siBMI1表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)。(圖2)。通過(guò)CCK8實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)BMI1敲低后對(duì)于細(xì)胞增殖水平的影響。 CCK8結(jié)果得出BMI1敲低后可有效抑制HeLa細(xì)胞的增殖能力(P<0.05)。(圖3)。

圖2 轉(zhuǎn)染后兩組細(xì)胞BMI1的表達(dá)量(P<0.05)

圖3 敲減BMI1抑制HeLa細(xì)胞的增殖(P<0.05)

2.3 敲減BMI1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞遷移的影響將畫(huà)線區(qū)域的細(xì)胞間距進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的劃痕寬度較之縮短，愈合能力降低明顯(P<0.05)，表明實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的遷移能力受到抑制。(圖4) 。

圖4 敲減BMI1抑制HeLa細(xì)胞的遷移(×100，P<0.05)

2.4 敲減BMI1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲的影響實(shí)驗(yàn)組相較于對(duì)照組可見(jiàn)，細(xì)胞的染色數(shù)目減少明顯(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(圖5)。

圖5 敲減BMI1抑制HeLa細(xì)胞的侵襲(×100,P<0.05)

2.5 敲減BMI1誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞術(shù)用來(lái)檢測(cè)BMI1敲減后對(duì)于HeLa細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示凋亡率在對(duì)照組為 (1.69±0.70)% ，在實(shí)驗(yàn)組為(4.89±0.30) %，表明敲減BMI1明顯誘導(dǎo)了HeLa細(xì)胞的凋亡。(圖6)。

圖6 敲減BMI1誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡(P<0.05)

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟參與的復(fù)雜過(guò)程[6-7]。近些年新興的分子靶向療法為癌癥的治療帶來(lái)了新的曙光，找到有效的致瘤靶點(diǎn)并研發(fā)出可與之結(jié)合的藥物是目前的研究熱門(mén)。

BMI 1是一種能在體外和動(dòng)物模型系統(tǒng)中誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的癌基因[8-9]。大量研究表明，BMI1的過(guò)度表達(dá)在許多癌癥中與疾病的晚期分期、侵襲性臨床病理行為及放化療的不良預(yù)后有關(guān)[10]。它是促進(jìn)前列腺癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤、膠質(zhì)瘤等發(fā)生的癌基因[11-15]。研究表明BMI1基因敲除可導(dǎo)致異種移植瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)減少[16]，并增加對(duì)細(xì)胞毒性藥物的敏感性[17]，這些均提示BMI1在細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生和惡性進(jìn)展中發(fā)揮了基礎(chǔ)作用。

結(jié)合本研究，qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMI1 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)較正常宮頸組織明顯增高，我們?cè)趯m頸癌HeLa細(xì)胞系中進(jìn)行體外相關(guān)實(shí)驗(yàn)。BMI1敲減后檢測(cè)宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力、遷移能力和凋亡能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了BMI1敲減后可使宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖力下降，侵襲、遷移能力受到明顯抑制，細(xì)胞的凋亡率顯著升高。由此可見(jiàn)，BMI1在宮頸癌的不斷進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著促癌基因的作用，敲減BMI1降低了宮頸癌HeLa細(xì)胞的惡性行為能力，其有可能抑制宮頸癌的發(fā)展，成為宮頸癌靶向治療的一個(gè)新方向。但因?yàn)橹皇褂昧藛我坏募?xì)胞系，實(shí)驗(yàn)結(jié)論方向較為單一，需要進(jìn)一步增加其它宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。