應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃的一步成苗培養(yǎng)基

趙春莉　姚思揚(yáng)　王嫚　王一飛　吳雙　湯昊　胡釗源

摘要：以軟棗獼猴桃?guī)а壳o段為外植體，利用響應(yīng)面法對其組培一步成苗試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以6-BA、NAA、IBA的濃度為試驗(yàn)因子，植株再生頻率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。結(jié)果表明：3因素對植株再生頻率的影響力大小為6-BA的濃度>IBA的濃度>NAA的濃度，最終得到的二元回歸方程顯示，一步成苗的培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為MS+6-BA 2.42 mg/L+NAA 0.27 mg/L+IBA 0.32 mg/L。在此條件下，最佳再生頻率預(yù)測值為4.23，實(shí)際操作結(jié)果為4.13。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面;一步成苗;再生頻率;軟棗獼猴桃;單因素試驗(yàn);回歸分析;再生頻率

中圖分類號(hào)： S663.404+.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0061-04

收稿日期：2018-07-12

基金項(xiàng)目：吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：20140204030NY、20140101271JC）;大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：2017496）。

作者簡介：趙春莉（1973—），女，山東壽光人，博士，副教授，主要從事觀賞植物資源引種馴化及繁殖技術(shù)研究。E-mail：zcl8368@163.com。

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）是獼猴桃科獼猴桃屬植物，分布廣闊，產(chǎn)量高，果實(shí)甜度高，富含維生素C、蛋白、氨基酸、果膠等成分，其中維生素C含量高達(dá)430.8 mg/100 g，是蘋果、梨的80～100倍，柑橘的5～10倍[1]，有極高的營養(yǎng)價(jià)值，還可加工成果脯、果汁、罐頭果醬、酒類等產(chǎn)品[2]。其根、莖、葉均可入藥，可治療消化不良、腹瀉、嘔吐和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛，有抗衰防癌的功效[3]。獼猴桃適應(yīng)能力強(qiáng)，種植范圍較廣，根系發(fā)達(dá)，可有效保持水土，提高土壤肥力，有良好的生態(tài)價(jià)值[4]。在園林景觀應(yīng)用上，它是一種很好的纏繞木，可作庭院景觀觀賞，可應(yīng)用在花架花棚的設(shè)計(jì)中[5]。軟棗獼猴桃應(yīng)用廣泛，具有良好的食用、藥用、生態(tài)、景觀價(jià)值，具有廣闊的經(jīng)濟(jì)市場。

軟棗獼猴桃傳統(tǒng)的繁殖方式為播種繁殖和扦插繁殖[6-8]，但種子繁殖易性狀分離，生長緩慢。扦插生根率不高，過度采集枝條有損母株[9]。組織培養(yǎng)可以保留植株優(yōu)良性狀，可快速大量地繁殖出苗。目前，已有相關(guān)軟棗獼猴桃組織培養(yǎng)的報(bào)道[9-12]。傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)試驗(yàn)是在每個(gè)階段篩選出合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境，轉(zhuǎn)接過程可能會(huì)造成污染，工作量大，周期長。一步成苗指在一個(gè)培養(yǎng)基內(nèi)完成誘導(dǎo)、增殖、生根階段，可節(jié)省成本，節(jié)省時(shí)間。目前，一步成苗技術(shù)還不夠成熟，軟棗獼猴桃的一步成苗研究未見報(bào)道。響應(yīng)面分析法普遍應(yīng)用于優(yōu)化試驗(yàn)中，可精確地反映各因素間的關(guān)系，預(yù)測出最佳優(yōu)化條件。本試驗(yàn)以軟棗獼猴桃?guī)а壳o段為外植體，研究單因素6-BA、IBA、NAA濃度對其一步成苗的影響，用響應(yīng)面法優(yōu)化軟棗獼猴桃一步成苗培養(yǎng)基，以期為今后相關(guān)研究提供理論實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為長白山野生軟棗獼猴桃?guī)а壳o段，于2017年5月采自吉林長白山地區(qū)，后用低溫保溫箱將外植體帶回吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的滅菌處理

將外植體用洗潔精洗凈灰塵，再用流水沖洗1 h。放在超凈工作臺(tái)的濾紙上吸干水分，放入滅菌后的燒杯中。加75%乙醇消毒30 s，用蒸餾水清洗4次，加0.1%三氯甲烷消毒6 min，用蒸餾水沖洗5次。消毒期間不斷振蕩，使試劑與材料充分接觸。

1.2.2 單因素試驗(yàn) [HJ1.4mm]

為探究每種生長激素的不同濃度對外植體產(chǎn)生的影響，以MS為基本培養(yǎng)基，將6-BA、IBA、NAA分別設(shè)置5種濃度：6-BA（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/L）;NAA（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L）;IBA（0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/L）。將外植體分別接種到培養(yǎng)基內(nèi)，每個(gè)處理接15個(gè)莖段，培養(yǎng)周期為50 d。

[CM（26]1.2.3 軟棗獼猴桃一步成苗培養(yǎng)基的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以6-BA、NAA、IBA濃度為試驗(yàn)因子，植株再生頻率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表1，每個(gè)水平處理10個(gè)莖段，培養(yǎng)周期為50 d。

1.2.4 培養(yǎng)條件

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，加入蔗糖 30 g/L、瓊脂粉8 g/L，pH值5.8～6.0。培養(yǎng)環(huán)境為：溫度（25±2） ℃，光照度2 000 lx，每天光照14 h。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

誘導(dǎo)率=出不定芽的外植體/接種的外植體數(shù)×100%;植株再生頻率=再生植株總數(shù)/接種的外植體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同6-BA濃度對外植體的影響

6-BA是一種常用的細(xì)胞分裂素，對細(xì)胞生長分化有良好的促進(jìn)作用。外植體接種15 d左右，有嫩綠色芽點(diǎn)產(chǎn)生，逐漸長大成為不定芽，30 d后部分不定芽會(huì)增殖出多個(gè)不定芽，當(dāng)6-BA濃度為10、2.0、3.0 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)率和增殖效果較好。當(dāng)6-BA濃度為 4.0 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)率和再生頻率都有所下降，可見濃度過高的 6-BA對外植體生長分化有抑制作用。50 d后，有部分不定芽長出須根，6-BA濃度為2.0 mg/L時(shí)，生根率較好，植株再生頻率最高。

2.1.2 不同NAA濃度對外植體的影響

由表3可知，低濃度的NAA對誘導(dǎo)與增殖的效果都很差，在NAA濃度大于 0.10 mg/L 時(shí)，誘導(dǎo)速度慢，25 d后才有不定芽形成，形成的不定芽少。在NAA濃度為0.20，0.40 mg/L時(shí)，20 d后即可誘導(dǎo)出不定芽，且30 d后增殖的不定芽較多;NAA濃度為 0.80 mg/L 時(shí)，對不定芽生長有抑制作用。50 d后，部分不定芽有根系生成，其中處理B3、B4的生根效果較好。最終篩選出最適宜外植體誘導(dǎo)分化的NAA最佳濃度為0.20 mg/L，最佳誘導(dǎo)率為60.00%，植株再生頻率為1.13。可見，單獨(dú)使用生長素NAA對植株再生效果不佳。

2.1.3 不同IBA濃度對外植體的影響

由表4可見，IBA濃度為0.05 mg/L時(shí)，誘導(dǎo)和增殖效果差。IBA濃度在 0.10 mg/L 以上時(shí)，20 d后有不定芽形成，誘導(dǎo)率較高，不定芽較多。隨著IBA濃度升高，誘導(dǎo)率和再生頻率都升高，30 d后增殖效果較明顯，50 d后，不定芽形成根且根系健壯。IBA濃度在0.80 mg/L時(shí)，再生苗的再生頻率有所下降。可見，IBA誘導(dǎo)外植體分化的最佳濃度為0.40 mg/L，再生頻率為1.27。

2.2 軟棗獼猴桃一步成苗培養(yǎng)基的優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 回歸方程分析

以6-BA濃度（X1）、NAA濃度（X2）、IBA濃度（X3）為自因素，以植株再生頻率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果（表5）得到回歸方程為：

Y=4.10+0.44X1-0.25X2+0.29X3-0.13X1X2-0.15X1X3+0.42X2X3-0.53X21-0.80X22-0.87X23，R2=0.964 0。該回歸模型的P值=0.000 3<0.01，有極顯著性;失擬項(xiàng)F值=0.177 6>0.05，無顯著性。說明該方程模型擬合度較好，試驗(yàn)誤差較小。表6顯示，X1、X12、X22、X32回歸系數(shù)極顯著（P<0.01），X2、X3、X2X3回歸系數(shù)顯著（P<0.05）。說明因素6-BA濃度對植物再生頻率有極顯著影響，IBA濃度與NAA濃度對其有顯著影響，且NAA濃度與IBA濃度的交互作用對植株再生頻率有顯著性影響。6-BA濃度與NAA濃度、IBA濃度的交互作用對結(jié)果影響不顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件繪制因素間交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖，結(jié)果見圖1至圖3，通過等高線、響應(yīng)面形狀來分析因素之間的交互作用以及對再生頻率的影響。其中，6-BA濃度對植株再生頻率的影響最大，其次是IBA濃度，對植株再生頻率影響最小的是NAA濃度。由此可以看出，存在最高點(diǎn)，所以最佳再生頻率出現(xiàn)在所選因素水平的范圍之內(nèi)。6-BA濃度與NAA濃度、IBA濃度的響應(yīng)面坡度較為平緩，對再生頻率的影響不顯著。NAA濃度與IBA濃度的響應(yīng)面最高點(diǎn)位于中間，邊緣形狀較陡，呈明顯凸字形，故NAA濃度與IBA濃度的交互作用對再生頻率有極顯著影響。

2.2.3 模擬方程的驗(yàn)證試驗(yàn)

通過二次回歸方程的分析可得出軟棗獼猴桃一步成苗的最優(yōu)條件為：6-BA濃度 2.42 mg/L，NAA濃度0.27 mg/L，IBA濃度0.32 mg/L，最佳再生頻率預(yù)測值為4.23。對該模型進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，每次處理10個(gè)莖段，得出的3次結(jié)果為4.3、3.9、4.2，平均結(jié)果為 4.13，與預(yù)測值十分接近，說明方程與真實(shí)試驗(yàn)擬合度較好，該優(yōu)化方案有實(shí)際意義和可行度。

3 討論與結(jié)論

關(guān)于軟棗獼猴桃的組培研究，通常要經(jīng)過誘導(dǎo)、增殖、生根的階段，要統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率、增殖率、生根率，每個(gè)階段都須要篩選出最佳培養(yǎng)基，一般每個(gè)階段需要20～30 d[13]，成苗至少需要80 d。一步成苗所有階段在1個(gè)培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行，并能產(chǎn)生完整植株，大大節(jié)省了成本、時(shí)間、人力，是一種新型的組培方法。試驗(yàn)選擇了6-BA、IBA、NAA 3種植物激素，其中細(xì)胞分裂素6-BA對外植體的誘導(dǎo)、分化、增殖有很好的促進(jìn)作用，生長素IBA、NAA對植物生長、生根都有很好的效果。單因素試驗(yàn)中6-BA對不定芽誘導(dǎo)的效果要好于IBA和NAA，有研究[14]篩選出最適合軟棗獼猴桃誘導(dǎo)的6-BA濃度是 1.5 mg/L，誘導(dǎo)率最高85.91%。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2.0 mg/L? 6-BA誘導(dǎo)效果更好，可達(dá)86.67%。

一步成苗最重要的參數(shù)是植株再生頻率，統(tǒng)計(jì)的是再生的帶有根系的完整植株，不同于傳統(tǒng)組培方法統(tǒng)計(jì)的增殖系數(shù)。接種30 d后，大部分植株基部有增殖的叢生芽產(chǎn)生，也有在莖段上增殖的現(xiàn)象，但這種幼嫩芽苗不計(jì)入試驗(yàn)結(jié)果。有研究在軟棗獼猴桃增殖階段的增殖系數(shù)最高可達(dá)5.86，高于本次試驗(yàn)的植株再生頻率，但該試驗(yàn)從接種到生根階段培養(yǎng)了80 d，本試驗(yàn)從接種到生根僅需50 d，減短了試驗(yàn)周期，簡化了試驗(yàn)步驟，節(jié)省了試驗(yàn)成本，為軟棗獼猴桃組培苗的高效工廠化生產(chǎn)提供了理論技術(shù)支持[13-14]。

響應(yīng)面分析法是用多元二次回歸方程將試驗(yàn)中的多種因素進(jìn)行擬合，通過對響應(yīng)面和等高線的分析，研究各因子與響應(yīng)值的關(guān)系[15]。相對于傳統(tǒng)試驗(yàn)方法，響應(yīng)面是一種試驗(yàn)次數(shù)少、回歸方程更為精準(zhǔn)、能反映各因素間交互作用的一種高效、經(jīng)濟(jì)、實(shí)用的分析方法[16-17]。由優(yōu)化試驗(yàn)得出的結(jié)果可知，最佳優(yōu)化培養(yǎng)基為：MS+6-BA 2.42 mg/L+NAA? 0.27 mg/L+IBA 0.32 mg/L，植株再生頻率為4.23，高于單因素試驗(yàn)的最佳值1.60，說明該優(yōu)化方案有可行性和實(shí)際意義。

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