甲基磺酸乙酯誘變篩選強(qiáng)耐鹽旱柳愈傷組織變異體研究

王瑩　郭聰　談峰　李玉娟

摘要：為獲得強(qiáng)耐鹽旱柳愈傷組織突變體，采用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理旱柳愈傷組織，對(duì)得到的旱柳愈傷組織變異體進(jìn)行耐鹽性檢驗(yàn)。結(jié)果表明，0.4% EMS處理3 h為旱柳愈傷組織的半致死處理方式;愈傷組織存活率和生長(zhǎng)率會(huì)隨鹽濃度的升高而降低，NaCl為0.4%時(shí)，愈傷組織的死亡率為93.6%;對(duì)篩選出的愈傷組織突變體進(jìn)行鹽脅迫形態(tài)與生理指標(biāo)檢驗(yàn)，誘變組SOD活性、POD活性、積累可溶性蛋白的能力比對(duì)照組高，而MDA含量始終低于對(duì)照組。旱柳愈傷組織突變體在0.4% NaCl脅迫下可正常生長(zhǎng)，而原親本只能耐受0.2%鹽濃度，誘變體比原親本耐鹽性提高了100%。

關(guān)鍵詞：甲基磺酸乙酯（EMS）;旱柳;強(qiáng)耐鹽性;愈傷組織;變異體

中圖分類號(hào)： S792.120.5;Q813.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）19-0057-04

收稿日期：2018-06-28

基金項(xiàng)目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（16）1005、CX（17）1004]。

作者簡(jiǎn)介：王 瑩（1986—），女，江蘇南通人，碩士，助理研究員，主要從事耐鹽苗木新品種培育及配套栽培技術(shù)方面的研究。E-mail：466625450@qq.com。

通信作者：李玉娟，副研究員，主要從事園林植物的育種、繁殖與栽培研究。E-mail：lyglyj90@sohu.com。

旱柳（Salix matsudana Koidz）為楊柳科（Salicaceae）柳屬（Salix）落葉喬木、灌木或亞灌木，在世界上分布廣泛[1]，具有速生、成材早等優(yōu)點(diǎn)，且具有一定的抗旱、耐鹽、耐瘠薄、抗風(fēng)沙能力，是平原地區(qū)重要的造林綠化植物，也是固堤護(hù)岸、防風(fēng)固沙、凈化大氣和改良鹽堿地的重要樹(shù)種[2]。隨著沿海開(kāi)發(fā)被提升為國(guó)家戰(zhàn)略之際，更多的科研工作者將沿海灘涂的綜合開(kāi)發(fā)與柳樹(shù)耐鹽性的遺傳改良工程相結(jié)合進(jìn)行研究。張繼明等利用傳統(tǒng)的雜交育種方式，進(jìn)行多年試驗(yàn)，選育出3個(gè)速生且抗鹽的優(yōu)良柳樹(shù)新品種[3];余春梅等利用分子生物學(xué)手段，在擬南芥中過(guò)量表達(dá)柳樹(shù)耐鹽性相關(guān)SVP1.1s基因，為選育優(yōu)良耐鹽林木提供重要材料[4]。但到目前為止，由于傳統(tǒng)方法的育種限制，其耐鹽等級(jí)大都僅局限于輕度或中度耐鹽水平[5]，強(qiáng)耐鹽柳或特耐鹽柳成功選育或已產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道鮮有報(bào)道，故柳樹(shù)資源的開(kāi)發(fā)利用受到了極大的制約。

誘變育種是一個(gè)非常規(guī)、有效的育種方式，其借用生物、化學(xué)或物理手段，在洋亞麻（Linumu sitatissimum L.）[6]、番茄（Lycopersicones culentum Mill.）[7]、紫花苜蓿（Medicago sativa）[8]等植物耐鹽新品系的培育中顯示出極其重要的作用和誘人的前景。其中甲基磺酸乙酯（EMS）是一個(gè)高效、穩(wěn)定的化學(xué)誘變劑，目前在植物誘變育種中應(yīng)用最廣泛、效果最好，誘變后產(chǎn)生的突變頻率高，且多為顯性突變體，易于進(jìn)行耐鹽突變體的篩選和育種[9]。近年來(lái)，育種工作者們通過(guò)EMS誘導(dǎo)耐鹽突變體途徑，已成功獲得了耐鹽番茄[7]、耐鹽纖維亞麻[10]、耐鹽菊花[Dendranthema morifolium （Ramat.） Tzvel.][11]等多種不同耐鹽等級(jí)的突變體植物新品種，大大豐富了耐鹽植物的種質(zhì)資源，對(duì)功能基因組學(xué)研究亦具有非常重要的作用。因此本研究在前期選育的強(qiáng)耐鹽柳樹(shù)新品系的基礎(chǔ)上，通過(guò)EMS人工化學(xué)誘導(dǎo)形成柳樹(shù)強(qiáng)耐鹽突變體方式，進(jìn)一步在細(xì)胞水平上進(jìn)行NaCl定向篩選，以期為旱柳強(qiáng)耐鹽品種的選育提供基礎(chǔ)材料，為耐鹽堿植物的選育提供一種高效的育種方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年3月在江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所組培實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。在本項(xiàng)目組前期建立的旱柳愈傷組織繁育體系基礎(chǔ)上，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯旱柳愈傷組織作為供試材料，進(jìn)行EMS誘變處理及鹽脅迫試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 EMS誘變處理及半致死量的確定 將旱柳愈傷組織放入無(wú)菌三角瓶中，加入不同濃度的EMS（0、0.2%、0.4%、0.6%）分別浸泡1、2、3、4 h，無(wú)菌水沖洗干凈后接種于培養(yǎng)基中，2周后統(tǒng)計(jì)成活率，最終確定旱柳的EMS最佳半致死劑量。

1.2.2 強(qiáng)耐鹽愈傷組織突變體的篩選 采用多步正篩選法，分別配制含愈傷組織誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，選取生長(zhǎng)健壯的旱柳愈傷塊，分別接種于不同NaCl（0、0.4%、0.6%、0.8%）培養(yǎng)基中，每7、14、21 d進(jìn)行取樣，統(tǒng)計(jì)愈傷組織成活率和生長(zhǎng)率，確定NaCl的95%致死劑量。

1.2.3 強(qiáng)耐鹽愈傷組織突變體耐鹽性及穩(wěn)定性分析

1.2.3.1 臨界濃度NaCl脅迫下繼代次數(shù)對(duì)愈傷組織存活率的影響 將篩選獲得的旱柳強(qiáng)耐鹽愈傷組織回接到無(wú)壓力的基本培養(yǎng)基中，然后選擇生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織再返回接到含NaCl（臨界濃度）的篩選培養(yǎng)基中，每2周繼代1次，共繼代6次，通過(guò)測(cè)定愈傷組織存活率，確定其耐鹽穩(wěn)定性。

1.2.3.2 臨界濃度NaCl脅迫對(duì)突變體愈傷組織各種耐鹽性指標(biāo)的影響 將獲得的強(qiáng)耐鹽旱柳愈傷組織突變體轉(zhuǎn)入不含鹽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3代后，再轉(zhuǎn)入含不同濃度NaCl（0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%）的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)照也培養(yǎng)相同時(shí)間，每30 d取樣，測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性蛋白含量、丙二醛（MDA）含量等相關(guān)耐鹽生理生化指標(biāo)，并與原親本相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理、計(jì)算及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 EMS誘變處理及半致死量的確定

從表1可以看出，旱柳愈傷組織成活率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)或EMS濃度升高而降低。在不加EMS條件下，愈傷組織的存活率均為100.00%;低濃度EMS處理對(duì)愈傷組織的殺傷力較弱，其平均存活率仍在60%以上;而當(dāng)EMS濃度達(dá)到06%及以上時(shí)，愈傷組織存活率較低。用0.4% EMS處理 3 h 條件下，其愈傷組織存活率達(dá)49.67%。最終根據(jù)50%致死劑量和存活率確定旱柳愈傷組織最佳處理方式為0.4% EMS浸泡3 h。

2.2 強(qiáng)耐鹽愈傷組織突變體的篩選

采用多步正篩法對(duì)旱柳強(qiáng)耐鹽愈傷組織突變體進(jìn)行篩選，如圖1、圖2顯示，旱柳的愈傷組織存活率和生長(zhǎng)率均隨鹽濃度的升高而降低。在NaCl的濃度低于0.2%時(shí)，鹽濃度對(duì)愈傷組織的成活率和分化率影響不大;當(dāng)NaCl濃度達(dá)到0.4%時(shí)，旱柳的愈傷組織存活率為6.3%，生長(zhǎng)率也表現(xiàn)出相似的趨勢(shì);0.6% NaCl處理時(shí)，愈傷組織幾乎不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制;而0.8% NaCl脅迫條件下，愈傷組織全部褐化死亡。根據(jù)NaCl對(duì)旱柳愈傷組織的95%致死劑量率和繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織的分化率表現(xiàn)，最終確定滿足試驗(yàn)要求的NaCl臨界濃度為0.4%。

2.3 臨界濃度NaCl脅迫下繼代次數(shù)對(duì)愈傷組織存活率的影響

在臨界濃度NaCl（0.4%）脅迫下繼代6次，結(jié)果如圖3顯示，通過(guò)誘變處理得到的旱柳愈傷組織在鹽脅迫下能表現(xiàn)出相對(duì)穩(wěn)定的耐受性，且隨著繼代次數(shù)的增加，存活率均能保持在50%以上，尤其在第3代時(shí)存活率最高，達(dá)到76.7%。

2.4 NaCl脅迫對(duì)突變體愈傷組織各種耐鹽性指標(biāo)的影響

2.4.1 不同NaCl脅迫對(duì)旱柳愈傷組織突變體SOD活性的影響 SOD活性的強(qiáng)弱，是植物抗逆性的重要指標(biāo)之一。由圖4看出，與對(duì)照組相比，誘變組的旱柳愈傷組織SOD活性明顯高于對(duì)照愈傷組織;0.2%濃度鹽脅迫下，對(duì)照組SOD活性最大;誘變組在0.4%濃度NaCl條件下活性最大，培養(yǎng) 30 d 時(shí)誘變的愈傷組織SOD活性最高，是對(duì)照組的2.46倍;60 d 時(shí)對(duì)照組SOD活性最低，僅為9.54 U/mg。這說(shuō)明，在鹽脅迫條件下，誘變組愈傷組織具有較高的SOD活性，來(lái)保護(hù)膜系統(tǒng)。

2.4.2 不同NaCl脅迫對(duì)旱柳愈傷組織突變體POD活性的影響 POD是存在于植物細(xì)胞中最重要的清除自由基的酶類之一。由圖5可以看出，當(dāng)旱柳愈傷組織處于逆境脅迫條件下時(shí)，POD活性先升高再下降，且誘變組POD活性均高于對(duì)照組;在培養(yǎng)30 d時(shí)，0.4% NaCl脅迫時(shí)POD活性達(dá)到最高值，為100.8 U/（g·min）。變異體愈傷組織在受到鹽脅迫時(shí)，比對(duì)照POD活性高，說(shuō)明誘變組愈傷組織比對(duì)照組具有更強(qiáng)的耐鹽適應(yīng)性。

2.4.3 不同NaCl脅迫對(duì)旱柳愈傷組織突變體MDA含量的影響 MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一。MDA含量的多少可代表膜損傷程度的大小。由圖6可知，誘變組的MDA含量始終低于對(duì)照組。愈傷組織在鹽脅迫條件下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組MDA含量先增加后下降;0.2%濃度鹽脅迫下，對(duì)照組培養(yǎng)30 d時(shí)MDA含量達(dá)到最大值（0.615 nmol/mL），是相同處理?xiàng)l件下誘變組的1.42倍。誘變愈傷組織的膜損傷程度低于對(duì)照，誘變愈傷組織比對(duì)照愈傷組織更適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境。

2.4.4 不同NaCl脅迫對(duì)旱柳愈傷組織突變體可溶性蛋白含量的影響 由圖7可見(jiàn)，隨著NaCl濃度的升高，對(duì)照組可溶性蛋白含量先增加后降低;在NaCl濃度0～0.4%，誘變組可溶性蛋白含量隨NaCl濃度的升高而升高，當(dāng)NaCl濃度為04%時(shí)，培養(yǎng)60 d時(shí)誘變組可溶性蛋白含量最高，為對(duì)照的 6.19倍，說(shuō)明耐鹽愈傷組織變異體在鹽脅迫條件下積累可溶性蛋白的能力大大強(qiáng)于對(duì)照。

3 結(jié)論與討論

EMS誘變技術(shù)是應(yīng)用最為廣泛的農(nóng)作物新品種育種技術(shù)之一，育種家們利用EMS誘變已成功創(chuàng)制出了大批具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病、抗逆等優(yōu)良農(nóng)藝性狀的新種質(zhì)資源[12-14]，而在林木誘變育種工作中尚不多見(jiàn)。本研究在明確適于旱柳的最佳EMS誘變條件基礎(chǔ)上開(kāi)展大規(guī)模EMS誘變處理，首次構(gòu)建了旱柳愈傷組織EMS突變體庫(kù)。在0.4% EMS浸泡處理3 h誘變條件下，獲得了一批旱柳愈傷組織突變體;再經(jīng)NaCl脅迫與逐級(jí)篩選，最終獲得了一批耐鹽性優(yōu)良的愈傷組織;通過(guò)生長(zhǎng)狀態(tài)觀察與生理指標(biāo)測(cè)定，旱柳愈傷組織突變體在0.4% NaCl脅迫下可正常生長(zhǎng)，而原親本只能耐受0.2%鹽濃度，誘變體比原親本耐鹽性提高了100%。本研究為耐鹽柳樹(shù)種質(zhì)創(chuàng)新以及功能基因組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)性材料。

EMS誘導(dǎo)涉及復(fù)雜的物理、化學(xué)過(guò)程，雖然突變效果明顯，但不同的材料適宜的處理濃度及誘導(dǎo)時(shí)間均有很大的差異，必須正確地掌握EMS誘變劑的最佳劑量、濃度以及處理時(shí)間。劉威等研究甲基磺酸乙酯的特性時(shí)發(fā)現(xiàn)，20 ℃下EMS半衰期為93.1 h，產(chǎn)物易溶于水且形成無(wú)誘變作用但對(duì)愈傷組織有一定毒害作用的有機(jī)酸，處理時(shí)間越長(zhǎng)毒害作用越強(qiáng)，選擇最適宜誘變劑濃度和處理時(shí)間尤為重要[15]。Bidabadi等在用EMS誘變香蕉莖尖時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同的香蕉品種對(duì)EMS耐受的半致死濃度不同[16]。張大燕等采用多濃度EMS對(duì)川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）進(jìn)行不同時(shí)間段的處理，篩選出了最佳的濃度與時(shí)間組合[17]。一般隨著EMS濃度的升高，材料致死率也會(huì)逐漸升高，本次試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)高濃度、長(zhǎng)時(shí)間處理旱柳愈傷組織，會(huì)導(dǎo)致組培材料的存活率和生長(zhǎng)率明顯降低，這與前人的EMS處理結(jié)果相似。同時(shí)研究過(guò)程中，在構(gòu)建的旱柳愈傷組織誘變體庫(kù)時(shí)，一部分材料在受到臨界濃度鹽脅迫時(shí)，突變性狀在后代中未能得到穩(wěn)定遺傳，尤其是第1次繼代，成活率僅為54.2%，這可能與EMS生理?yè)p傷、試驗(yàn)群體大小、突變性狀調(diào)控的復(fù)雜性等因素有一定的關(guān)系。

在田小霞等的研究中發(fā)現(xiàn)，在受到鹽脅迫時(shí)，材料細(xì)胞會(huì)通過(guò)積累大量的可溶性蛋白，增加SOD、POD活性等一系列的生理生化反應(yīng)來(lái)適應(yīng)逆境[18-19]，本試驗(yàn)也得到了與之相似的研究結(jié)果。EMS是一種常見(jiàn)的烷化劑之一，其分子具有多個(gè)能被轉(zhuǎn)移的活性烷基，可轉(zhuǎn)移到電子云密度較高的分子上，置換堿基中的H原子[20]。EMS誘變使旱柳DNA分子上產(chǎn)生較多的點(diǎn)突變，鹽脅迫后變異體與對(duì)照組生理生化指標(biāo)呈現(xiàn)出明顯的差異，同處理?xiàng)l件下，SOD、POD活性和可溶性蛋白含量最多，分別比對(duì)照提高了5.1倍、9.2倍和5.2倍，對(duì)照組培養(yǎng)30 d時(shí)MDA達(dá)到最大值，在相同處理?xiàng)l件下是誘變組的1.42倍。綜合各生理指標(biāo)，說(shuō)明鹽脅迫對(duì)旱柳愈傷組織變異體的損傷較小。

本研究只針對(duì)EMS誘變處理的濃度和時(shí)間組合對(duì)旱柳愈傷組織的生長(zhǎng)和耐鹽性生理指標(biāo)做了研究，初步選擇出耐鹽性良好的旱柳愈傷組織變異體，為日后強(qiáng)耐鹽柳樹(shù)突變植株的培育提供材料。但是誘變后如何對(duì)再生植株進(jìn)行鑒定分析，如何篩選具有目的性狀并可以穩(wěn)定遺傳的變異植株，以及深入開(kāi)展旱柳強(qiáng)耐鹽突變體庫(kù)基因突變位點(diǎn)分布和誘變機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究。

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