miR-9靶向FOXP1對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制研究

聞淑娟　張珍連　李?yuàn)櫋『馈≈炝铡“⒆喂披悺満消溙帷铐樁?/p>

[摘要]目的 探討FOXP1上游靶標(biāo)miR-9對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）細(xì)胞的作用及機(jī)制。方法 Targetscan分析miR-9與FOXP1的結(jié)合，miR-9與FOXP1結(jié)合通過熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;以轉(zhuǎn)染mimic Con為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染mimic miR-9過表達(dá)miR-9后，Western blot檢測FOXP1表達(dá)變化;實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測人DLBCL細(xì)胞OCI-Ly3和人B淋巴母細(xì)胞IM9中miR-9的表達(dá)水平;過表達(dá)miR-9后，體外檢測OCI-Ly3的增殖以及侵襲能力的變化。結(jié)果 轉(zhuǎn)染miR-9后，mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組的熒光素酶活性低于轉(zhuǎn)染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）;過表達(dá)miR-9后，mimic miR-9組的FOXP1表達(dá)水平低于mimic Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;miR-9在人DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3細(xì)胞中的表達(dá)水平低于B淋巴母細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;過表達(dá)miR-9后，OCI-Ly3細(xì)胞的增殖和侵襲能力低于mimic Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 miR-9下調(diào)通過靶向FOXP1促進(jìn)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

[關(guān)鍵詞]彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤;miRNA;miR-9;FOXP1

[中圖分類號(hào)] R733.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）10（c）-0007-05

[Abstract] Objective To investigate the effect and mechanism of FOXP1 upstream target miR-9 on diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） cells. Methods Targetscan was used to analyze the binding of miR-9 to FOXP1， the luciferase gene reporter assay confirmed the binding of miR-9 to FOXP1. Transfection mimic Con was used as the control group， after transfection of mimic miR-9 after overexpression of miR-9， FOXP1 expression was detected by Western blot. The real-time fluorogenic quantitative PCR （RT-PCR） was used to detect the expression level of miR-9 in human DLBCL cells OCI-Ly3 and B lymphoblastic cell IM9. After overexpression of miR-9， the proliferation and invasion ability of OCI-Ly3 were detected in vitro. Results After transfection with miR-9， the luciferase activity of the mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT group was lower than that in the mimic Con+FOXP1 3′UTR WT group， the difference was statistically significant （P<0.0001）. After overexpression of miR-9， the FOXP1 expression level of mimic miR-9 group was lower than that in the mimic Con group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The expression level of miR-9 in human DLBCL cell line OCI-Ly3 was lower than that of B lymphocyte， the difference was statistically significant （P<0.05）. After overexpression of miR-9， OCI-Ly3 cells had lower proliferation and invasion ability than those in the mimic Con group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Down-regulation of miR-9 promotes proliferation and invasion of diffuse large B-cell lymphoma cells by targeting FOXP1.

[Key words] Diffuse large B-cell lymphoma; miRNA; miR-9; FOXP1

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin′s lymphoma，NHLs）的30%～40%，是常見的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤之一[1]。所有年齡組中都檢測得到DLBCL，包括兒科患者，然而，隨著患者年齡的增長，DLBCL 發(fā)病率也增加，70歲以上患者最常見。男性DLBCL的發(fā)病率相對(duì)高于女性[2-3]。DLBCLs的生物學(xué)特性、基因突變和免疫表型多種多樣，直到現(xiàn)在，DLBCL的發(fā)病機(jī)制仍然很不清楚[4]。

miRNA是具有單鏈的非編碼RNA分子[5]。miRNA可以促進(jìn)其靶向的mRNA降解，干擾翻譯過程發(fā)揮基因表達(dá)的調(diào)控作用[6]。miRNA在幾乎所有細(xì)胞過程中都具有重要作用，它們?cè)诩?xì)胞增殖分化等許多細(xì)胞過程發(fā)揮作用[7]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)miRNA已成為癌癥進(jìn)展中的重要參與者。miRNA可以抑制或促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。例如，過表達(dá)的miR-142-5p可以抑制胰腺癌的生長[9];miR-187靶向MAPK12抑制骨肉瘤的生長;免疫反應(yīng)中，miR-424通過T細(xì)胞調(diào)節(jié)上皮性卵巢癌的化療耐藥性[10]。miR-9的表達(dá)與細(xì)胞分化、增殖、遷移和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。在多種癌癥中觀察到miR-9的異常表達(dá)[11]，表明miR-9參與癌癥的發(fā)生。然而，目前有關(guān)miR-9在DLBCL中的作用尚不確定。

本研究通過miRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測FOXP1上游靶標(biāo)分子miR-9，檢測DLBCL細(xì)胞OCI-Ly3中miR-9的表達(dá)水平，并測試miR-9對(duì)OCI-Ly3增殖和侵襲能力的影響，探究miR-9對(duì)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的作用及機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1材料

DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3（上海拜力生物有限科技公司）;人B淋巴母細(xì)胞系IM9（武漢尚碼生物科技有限公司）;RPMI1640（sigma）;FBS（杭州四季青）;miR-9及U6特異性引物（廣州銳博生物科技有限公司）;mimic miR-9（廣州銳博生物科技有限公司）;FOXP1抗體（proteintech）;PCR試劑盒（Vazyme Biotech）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)? DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3和人B淋巴母細(xì)胞系IM9在37℃細(xì)胞恒溫箱中孵育，RPMI1640補(bǔ)充有10%（V/V）的FBS、青霉素（100 U/ml）和鏈霉素（100 U/ml）。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量? 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）TRIzol法提取總RNA。使用PCR試劑盒逆轉(zhuǎn)錄miR-9。之后，使用RT-PCR檢測成熟miR-9的表達(dá)，使用U6特異性引物作為內(nèi)參。

1.2.3熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)? 根據(jù)Targetscan軟件預(yù)測miR-9與FOXP1 mRNA 3′-UTR區(qū)結(jié)合序列。將含該結(jié)合位點(diǎn)的片段插入到熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。構(gòu)建兩組質(zhì)粒：包含該結(jié)合位點(diǎn)的野生型質(zhì)粒（FOXP1 3′UTR WT）以及突變?cè)摻Y(jié)合位點(diǎn)的突變質(zhì)粒（FOXP1 3′UTR Mut）。轉(zhuǎn)染OCL-LY-3細(xì)胞miR-9 mimic和兩組質(zhì)粒，摩爾比為50∶1。miRNA對(duì)照用作陰性對(duì)照。24 h后根據(jù)說明書（Promega，E2920），測定熒光素酶活性。

1.2.4 miR-9轉(zhuǎn)染? 將OCI-Ly3細(xì)胞系鋪板，根據(jù)銳博生物科技公司提供的說明書，使用lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，mimic miR-9用于過表達(dá)miR-9，對(duì)照組轉(zhuǎn)染mimic Con。24～48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5細(xì)胞增殖檢測? 對(duì)轉(zhuǎn)染miR-9 mimic的OCI-Ly3細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測，檢測起點(diǎn)記為0 h，分別在0、6、12、24 h收集細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.6細(xì)胞侵襲能力檢測? 使用Transwell進(jìn)行體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。簡而言之，Transwell小室PVDF膜上用基質(zhì)膠與處理，細(xì)胞恒溫箱中平衡2 h。PBS清洗1遍，在Transwell內(nèi)室加入細(xì)胞懸液（1×105細(xì)胞/孔），恒溫箱中孵育24 h。輕輕擦去靠近內(nèi)側(cè)細(xì)胞，另用甲醛室溫固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，PBS洗3遍，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每組設(shè)三復(fù)孔。

1.2.7 Western blot分析? RIPA裂解液裂解細(xì)胞，在冰上提取總蛋白;于4℃條件下，12 000 g離心20 min;BCA蛋白定量;12%十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法制得PVDF膜;用TBST洗滌PVDF膜3次，每次15 min;5%脫脂牛奶室溫封閉2 h;加入一抗（FOXP1，1∶1000），4℃過夜;用TBST洗滌3次，每次15 min;室溫孵育二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG二抗，1∶2000）2 h;用TBST洗滌3次，每次15 min;用化學(xué)發(fā)光顯色法顯影，拍照統(tǒng)計(jì)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

分組包括如下：①熒光素基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)分組，包括mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組、mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組、mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut組及mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut組。②miR-9對(duì)FOXP1表達(dá)調(diào)控作用驗(yàn)證分組，包括mimic Con組及mimic miR-9組。③miR-9在人DLBCL細(xì)胞OCI-Ly3和人B淋巴母細(xì)胞IM9中表達(dá)水平驗(yàn)證分組，包括B淋巴母細(xì)胞組及人DLBCL組。④miR-9對(duì)OCI-Ly3細(xì)胞體外增殖以及侵襲能力的作用驗(yàn)證：mimic Con組，mimic miR-9組。

1.4觀察指標(biāo)

本研究觀察指標(biāo)包括：①比較mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組與mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組的熒光素酶活性，熒光素酶活性降低降低，表明miR-9與FOXP1結(jié)合;②比較mimic Con組與mimic miR-9組的FOXP1表達(dá)水平，F(xiàn)OXP1表達(dá)水平降低，表明miR-9抑制FOXP1表達(dá);③比較人DLBCL細(xì)胞OCI-Ly3和人B淋巴母細(xì)胞IM9中miR-9的表達(dá)水平;④比較mimic Con組與mimic miR-9組OCI-Ly3細(xì)胞增殖數(shù)目以及穿過Transwell的細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞計(jì)數(shù)降低，表明miR-9抑制OCI-ly3細(xì)胞體外增殖和侵襲。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 miR-9與FOXP1結(jié)合

利用miRNA靶基因預(yù)測軟件Targetscan預(yù)測出miR-9與FOXP1直接結(jié)合，預(yù)測結(jié)果見圖1，封三。并采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-9與FOXP1的結(jié)合，結(jié)果提示，mimic miR-9+FOXP1 3′UTR WT組的熒光素酶活性低于轉(zhuǎn)染mimic Con+FOXP1 3′UTR WT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），mimic Con+FOXP1 3′UTR Mut組與mimic miR-9+FOXP1 3′UTR Mut組的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（圖2）。

2.2過表達(dá)miR-9對(duì)FOXP1表達(dá)的影響

過表達(dá)miR-9對(duì)FOXP1表達(dá)的影響，結(jié)果見圖3，結(jié)果提示，過表達(dá)miR-9抑制FOXP1表達(dá)。在DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3細(xì)胞中使用mimic miR-9過表達(dá)miR-9，mimic miR-9組的FOXP1表達(dá)水平低于mimic Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

2.3 miR-9在DLBCL細(xì)胞系和B淋巴母細(xì)胞中的表達(dá)情況

結(jié)果提示，人DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3細(xì)胞的miR-9表達(dá)水平低于B淋巴母細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。

2.4過表達(dá)miR-9對(duì)OCI-Ly3細(xì)胞增殖的影響

在OCI-Ly3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-9 mimic后進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測，結(jié)果提示，在轉(zhuǎn)染后12、24、48 h后，mimic miR-9組的細(xì)胞數(shù)目少于mimic Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖6）。

2.5過表達(dá)miR-9對(duì)OCI-Ly3細(xì)胞體外侵襲能力的影響

在OCI-Ly3細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-9 mimic后進(jìn)行Transwell體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，mimic Con組穿過Transwell的細(xì)胞數(shù)為（879±24）個(gè)，mimic miR-9組穿過Transwell的數(shù)目為（487±28）個(gè)。mimic miR-9組穿過Transwell的數(shù)目少于mimic Con組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.635，P<0.001）。

3討論

FOXP1在許多生物過程中起著重要作用，包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育和功能[12-15]。此外，F(xiàn)OXP1已被確認(rèn)為是肝細(xì)胞癌、胰腺癌和各種類型的B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的潛在致癌基因[16-18]。研究發(fā)現(xiàn)， DLBCL和粘膜相關(guān)淋巴組織（MALT）淋巴瘤中，F(xiàn)OXP1的高表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)聯(lián)，并且促使其轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性淋巴瘤[19-20]。長期以來，F(xiàn)OXP1被認(rèn)為是DLBCL中推定的致癌基因，其通過促進(jìn)B細(xì)胞存活，抑制漿細(xì)胞分化，增強(qiáng)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)和抑制主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子表達(dá)等機(jī)制發(fā)揮致癌作用[21-23]。

miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平介導(dǎo)mRNA降解從而調(diào)控基因表達(dá)。本研究通過Targetscan數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，miR-9可以與FOXP1的3′UTR區(qū)結(jié)合。通過熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-9與FOXP1的結(jié)合。過表達(dá)miR-9則導(dǎo)致FOXP1的表達(dá)水平降低，進(jìn)一步證實(shí)miR-9作為FOXP1的上游靶標(biāo)分子，調(diào)控FOXP1的表達(dá)。而FOXP1已經(jīng)在DLBCL中進(jìn)行了廣泛的研究，已知它可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞的存活和侵襲性，高FOXP1水平的DLBCL預(yù)后更差。因此其上游靶標(biāo)分子miR-9在DLBCL中可能發(fā)揮重要作用。RT-PCR結(jié)果顯示，在DLBCL細(xì)胞系中miR-9的表達(dá)低于人淋巴母細(xì)胞IM9。鑒于miR-9與FOXP1的3′-UTR區(qū)的結(jié)合及其對(duì)FOXP1的調(diào)節(jié)作用，miR-9的異常表達(dá)可能是導(dǎo)致FOXP1在DLBCL中高表達(dá)的機(jī)制之一。在DLBCL細(xì)胞系OCI-Ly3中過表達(dá)miR-9，可以抑制OCL-Ly3細(xì)胞的增殖和侵襲能力。表明miR-9可以靶向FOXP1調(diào)節(jié)DLBCL細(xì)胞的增殖和侵襲能力。miR-9的表達(dá)失調(diào)可能是促進(jìn)DLBCL發(fā)展的機(jī)制之一。

綜上所述，miR-9通過靶向FOXP1在DLBCL中起關(guān)鍵作用。MiR-9表達(dá)失調(diào)可通過上調(diào)其下游靶標(biāo)分子FOXP1表達(dá)促進(jìn)DLBCL細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究有助于了解miR-9在DLBCL中的作用及機(jī)制，然而，miR-9是否也通其他分子靶標(biāo)調(diào)節(jié)DLBCL發(fā)生發(fā)展過程，仍有待進(jìn)一步的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Ren W，Ye X，Su H，et al.Genetic landscape of hepatitis B virus-associated diffuse large B-cell lymphoma[J].Blood，2018，131（24）：2670-2681.

[2]Twa DDW，Mottok A，Savage KJ，et al.The pathobiology of primary testicular diffuse large B-cell lymphoma：Implications for novel therapies[J].Blood Rev，2018，32（3）：249-255.

[3]Jacobsen E，La Casce A.Update on the therapy of highly aggressive non-Hodgkin′s lymphoma[J].Expert Opin Biol Ther，2006，6（7）：699-708.

[4]Shimono J，Miyoshi H，Kiyasu J，et al，Clinicopathological analysis of primary splenic diffuse large B-cell lymphoma[J].Br J Haematol，2017，178（5）：719-727.

[5]Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120（1）：15-20.

[6]Jonas S，Izaurralde E.Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing[J].Nat Rev Genet，2015， 16（7）：421-433.

[7]Krol J，Loedige I，F(xiàn)ilipowicz W.The widespread regulation of microRNA biogenesis，function and decay[J].Nat Rev Genet，2010，11（9）：597-610.

[8]Croce CM.Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer[J].Nat Rev Genet，2009，10（10）：704-714.

[9]Jia L，Xi Q，Wang H，et al.miR-142-5p regulates tumor cell PD-L1 expression and enhances anti-tumor immunity[J].Biochem Biophys Res Commun，2017，488（2）：425-431.

[10]Xu S，Tao Z，Hai B，et al.miR-424（322） reverses chemoresistance via T-cell immune response activation by blocking the PD-L1 immune checkpoint[J].Nat Commun，2016，7：11 406.

[11]Khafaei M，Rezaie E，Mohammadi A，et al.miR-9：From function to therapeutic potential in cancer[J].J Cell Physiol，2019.

[12]Koon HB，Ippolito GC，Banham AH，et al.FOXP1：a potential therapeutic target in cancer[J].Expert Opin Ther Targets，2007，11（7）：955-965.

[13]Banham AH，Connors JM，Brown PJ，et al.Expression of the FOXP1 transcription factor is strongly associated with inferior survival in patients with diffuse large B-cell lymphoma[J].Clin Cancer Res，2005，11（3）：1065-72.

[14]Patzelt T，Keppler SJ，Gorka O，et al.Foxp1 controls mature B cell survival and the development of follicular and B-1 B cells[J].Proc Natl Acad Sci USA，2018，115（12）：3120-3125.

[15]Konopacki C，Pritykin Y，Rubtsov Y，et al.Transcription factor Foxp1 regulates Foxp3 chromatin binding and coordinates regulatory T cell function[J].Nat Immunol，2019，20（2）：232-242.

[16]He J，Yang Z，Wu Z，et al.Expression of FOXP1 and FOXO3a in extrahepatic cholangiocarcinoma and the implications in clinicopathological significance and prognosis[J].Onco Targets Ther，2019，12：2955-2965.

[17]De Silva P，Garaud S，Solinas C，et al.FOXP1 negatively regulates tumor infiltrating lymphocyte migration in human breast cancer[J].E Bio Med，2019，39：226-238.

[18]Mottok A，Jurinovic V，F(xiàn)arinha P，et al.FOXP1 expression is a prognostic biomarker in follicular lymphoma treated with rituximab and chemotherapy[J].Blood，2018，131（2）：226-235.

[19]Dekker JD，Park D，Shaffer AL，et al.Subtype-specific addiction of the activated B-cell subset of diffuse large B-cell lymphoma to FOXP1[J].Proc Natl Acad Sci USA，2016，113（5）：E577-E586.

[20]van Keimpema M，Grüneberg LJ，Schilder-Tol EJ，et al.The small FOXP1 isoform predominantly expressed in activated B cell-like diffuse large B-cell lymphoma and full-length FOXP1 exert similar oncogenic and transcriptional activity in human B cells[J].Haematologica，2017，102（3）：573-583.

[21]van Keimpema M，Grüneberg LJ，Mokry M，et al.FOXP1 directly represses transcription of proapoptotic genes and cooperates with NF-kappaB to promote survival of human B cells[J].Blood，2014，124（23）：3431-3440.

[22]Brown PJ，Wong KK，F(xiàn)elce SL，et al.FOXP1 suppresses immune response signatures and MHC class Ⅱ expression in activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphomas[J].Leukemia，2016，30（3）：605-616.

[23]Visco C，Li Y，Xu-Monette ZY，et al.Comprehensive gene expression profiling and immunohistochemical studies support application of immunophenotypic algorithm for molecular subtype classification in diffuse large B-cell lymphoma：a report from the International DLBCL Rituximab-CHOP Consortium Program Study[J].Leukemia，2012，26（9）：2103-2113.

（收稿日期：2019-07-04? 本文編輯：孟慶卿）