平突散系列復(fù)方對(duì)CD40L刺激后人球后成纖維細(xì)胞的MMP和TIMP表達(dá)的影響

萬紅，陳亞琳，崔亞萍，余丹丹，燕樹勛，3*

甲狀腺相關(guān)性眼病（TAO）是一種危及視力且損傷眼部器官的自身免疫性疾?。?］，其主要病變部位在眼眶結(jié)締組織及眼外肌，臨床表現(xiàn)為眼球前突、復(fù)視、斜視、暴露性角膜炎和壓迫性視神經(jīng)病變等眼部器官損傷及視力下降，甚至失明，嚴(yán)重者需摘除眼球［2-3］。TAO的治療是業(yè)界公認(rèn)的難題，治療手段有一般支持治療（如戒煙）、藥物治療（如糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等）、眼眶放射治療、手術(shù)治療，目前只能達(dá)到緩解眼部不適的目的且不良反應(yīng)較多［4］。

中醫(yī)藥在改善TAO臨床癥狀方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但是作用機(jī)制一直不清楚。部分研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素、夏枯草、浙貝提取物以及中藥復(fù)方能夠通過抑制人球后成纖維細(xì)胞（RFs）的增殖；抑制透明質(zhì)酸（HA）和膠原的合成；抑制干擾素（IFN）-γ刺激后細(xì)胞間黏附分子（ICAM）-1、HLA-DR、CD40的過度表達(dá)等途徑，發(fā)揮其治療作用［5-11］。

本研究旨在觀察CD40L干預(yù)體外培養(yǎng)的RFs，建立TAO實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察瀉火平突散、活血平突散、養(yǎng)目平突散含藥血清對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）、MMP組織抑制劑（TIMP）表達(dá)的影響，進(jìn)而進(jìn)一步探討平突散系列復(fù)方治療TAO的可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 中藥顆粒劑的制備 中藥復(fù)方顆粒劑購(gòu)于四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，并由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥制劑室制備成3 g/ml口服液。瀉火平突散藥物組成：龍膽草 15 g、菊花 10 g、夏枯草 30 g、梔子 15 g、黃芩 15 g、青黛 15 g、黃藥子 9 g、牡丹皮 15 g、赤芍 12 g、青葙子 15 g、白蒺藜15 g?；钛酵簧⑺幬锝M成：赤芍15 g、山慈菇20 g、穿山甲 9 g、澤蘭 15 g、生牡蠣 15 g、三棱 15 g、莪術(shù) 15 g、玄參 20 g、浙貝 15 g、黃藥子 9 g、鱉甲 10 g、澤瀉 15 g。養(yǎng)目平突散藥物組成：旱蓮草30 g、女貞子30 g、熟地20 g、玄參 20 g、丹皮 20 g、白芍 15 g、鱉甲 10 g、浙貝 15 g、茺蔚子20 g、莪術(shù) 15 g、白芥子 20 g、牡蠣 15 g。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與含藥血清的制備 2016年9月選取35只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量250～300 g。由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給，動(dòng)物合格證號(hào)：0001611，許可證號(hào)：SCXK（豫）2016-011。大鼠按體質(zhì)量分層隨機(jī)分為對(duì)照組、A組（給予瀉火平突散）、B組（給予養(yǎng)目平突散）、C組（給予活血平突散）。其中對(duì)照組5只，其余每組各10只。4組均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)3 d后，按照人體表面積換算60 g·kg-1·d-1灌胃給藥（對(duì)照組給予超純水灌胃），每天根據(jù)大鼠體質(zhì)量的不同調(diào)整給藥量，3次/d，連續(xù)灌胃3 d。其中A、C組各死亡1只大鼠。其余大鼠于最后一次給藥1 h后，以0.4 ml/100 g劑量將4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，無菌下腔靜脈采血。血清于4 ℃冰箱內(nèi)放置3 h后離心、取上清液、滅活，-70 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RFs的培養(yǎng) 本研究中所用的人RFs來源于2例眼創(chuàng)傷患者（2014年取材于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科），1例為創(chuàng)傷性白內(nèi)障（男，4歲），另外1例為雙眼晶狀體半脫位（男，6歲），均征得其家屬同意。按照文獻(xiàn)［11］進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，成功復(fù)蘇體外培養(yǎng)的RFs，在光鏡下觀察可見細(xì)胞形狀為梭形和多角形，2～3 d后細(xì)胞平鋪覆蓋瓶壁面積的80%～90%。細(xì)胞鑒定的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果為纖維原細(xì)胞的標(biāo)記細(xì)胞波形蛋白（vimentin）為陽(yáng)性，細(xì)胞角蛋白（cytokeration）為陰性，判定為RFs［5］。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為2～5代細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)和性能在各代間均無顯著差異。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組以及免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組如下，空白組：給予正常培養(yǎng)液；血清組：給予含10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液；CD40L組：給予含 100 ng/ml CD40L的培養(yǎng)液；CD40L+血清組：給予含100 ng/ml CD40L和10%正常大鼠血清的培養(yǎng)液；瀉火平突散組：給予含有100 ng/ml CD40L和10%含藥血清的培養(yǎng)液；活血平突散組：給予含有100 ng/ml CD40L與10%含藥血清的培養(yǎng)液；養(yǎng)目平突散組：給予含有100ng/ml CD40L與10%含藥血清的培養(yǎng)液。免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組MMP-1、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2在RFs中表達(dá)的平均光密度值［12］。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)6次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組MMP-1、MMP-2的表達(dá)CD40L組MMP-1活性低于空白組、CD40L+血清組MMP-1活性低于血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；瀉火平突散、活血平突散、養(yǎng)目平突散組MMP-1高于CD40L+血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；養(yǎng)目平突散組MMP-1活性高于瀉火平突散組、活血平突散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和血清組MMP-1活性、CD40L組和CD40L+血清組MMP-1活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

CD40L組MMP-2活性低于空白組、CD40L+血清組MMP-2活性低于血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；瀉火平突散、活血平突散、養(yǎng)目平突散組MMP-2活性高于CD40L+血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；養(yǎng)目平突散組MMP-2活性高于瀉火平突散組、活血平突散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和血清組MMP-2活性、CD40L組和CD40L+血清組MMP-2活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表1）。

2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組TIMP-1、TIMP-2的表達(dá) CD40L組TIMP-1活性高于空白組、CD40L+血清組TIMP-1活性高于血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；瀉火平突散、活血平突散、養(yǎng)目平突散組TIMP-1活性低于CD40L+血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；養(yǎng)目平突散組TIMP-1活性低于瀉火平突散組、活血平突散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和血清組TIMP-1活性、CD40L組和CD40L+血清組TIMP-1活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

CD40L組TIMP-2活性高于空白組、CD40L+血清組TIMP-2活性高于血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；瀉火平突散、活血平突散、養(yǎng)目平突散組TIMP-2活性低于CD40L+血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；養(yǎng)目平突散組TIMP-2活性低于瀉火平突散組、活血平突散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；空白組和血清組TIMP-2活性、CD40L組和CD40L+血清組TIMP-2活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表2）。

表2 各組TIMP-1、TIMP-2比較（x±s，n=6）Table 2 Comparison of mean expression levels of TIMP-1 and TIMP-2 in seven groups

2.3 各組MMP-1/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2比較 CD40L組MMP-1/TIMP-1低于空白組、CD40L+血清組MMP-1/TIMP-1低于血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；瀉火平突散、活血平突散、養(yǎng)目平突散組MMP-1/TIMP-1活性高于CD40L+血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；養(yǎng)目平突散組MMP-1/TIMP-1高于瀉火平突散組、活血平突散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和血清組MMP-1/TIMP-1、CD40L組和CD40L+血清組MMP-1/TIMP-1比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

CD40L組MMP-2/TIMP-2低于空白組、CD40L+血清組MMP-2/TIMP-2低于血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；瀉火平突散、活血平突散、養(yǎng)目平突散組MMP-2/TIMP-2高于CD40L+血清組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；養(yǎng)目平突散組MMP-2/TIMP-2高于瀉火平突散組、活血平突散組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；空白組和血清組MMP-2/TIMP-2、CD40L組和CD40L+血清組MMP-2/TIMP-2比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表3）。

表3 各組MMP-1/TIMP-1、MMP-2/TIMP-2比較（x±s，n=6）Table 3 Comparison of mean ratio of MMP-1/TIMP-1，MMP-2/TIMP-2 in seven groups

3 討論

3.1 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)TAO的認(rèn)識(shí) TAO是一種自體免疫性疾病，且具有一定程度的器官特異性，特異性組織學(xué)變化是眼球后組織大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、糖氨多糖和膠原蛋白的沉積及球后組織纖維化。TAO確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，而目前有研究證實(shí)，在TAO發(fā)展過程中，RFs作為效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，在眼眶組織免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)、脂肪細(xì)胞的分化和增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）方面起了重要作用［13］。

研究證實(shí)在TAO患者RFs上存在CD40的異常表達(dá)，當(dāng)RFs將球后的自身抗原提呈給轉(zhuǎn)運(yùn)至眼球后的T細(xì)胞形成HLA-TCR復(fù)合物時(shí)，T細(xì)胞表面的CD40L與RFs上的CD40結(jié)合，使RFs活化并上調(diào)多種協(xié)同刺激分子的表達(dá)，在雙信號(hào)的作用下，T細(xì)胞被激活為針對(duì)自身抗原的殺傷性T細(xì)胞，分泌多種細(xì)胞因子，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)；RFs通過表達(dá)CD40分子，并且與CD40L結(jié)合而被激活，激活后主要促進(jìn)透明質(zhì)酸（HA）的合成、前列腺素E2（PGE2）的生成此外CD40L能上調(diào)IL-1α的合成，刺激RFs增生和氨基多糖合成［14-16］。故CD40-CD40L代表著一個(gè)重要的成纖維細(xì)胞活化通路，是GO的分子致病基礎(chǔ)，阻斷CD40-CD40L途徑可能是治療TAO的一個(gè)新方向。

ECM的沉積作為TAO的重要病理表現(xiàn)，能夠引起球后組織的水腫，導(dǎo)致患者出現(xiàn)復(fù)視、斜視甚至壓迫視神經(jīng)導(dǎo)致失明。作為能夠水解ECM的蛋白裂解酶，MMP的主要功能是降解ECM，從而在組織重建和修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用。在正常的生理?xiàng)l件下，MMP和TIMP相互配合，保持著ECM降解和重塑的平衡。但當(dāng)發(fā)生病理改變時(shí)，這種平衡狀態(tài)被破壞，進(jìn)一步引起組織病理學(xué)的改變。有研究表明，MMP/TIMP失衡表現(xiàn)為MMP表達(dá)下降，而TIMP表達(dá)上調(diào)從而致使眶后組織ECM降解不足而積聚過多，這也正是造成眼球突出的重要因素之一［17］。

3.2 中醫(yī)對(duì)TAO的認(rèn)識(shí) 古籍中對(duì)TAO描述為“目如火赤，綻大脹于睥間，不能斂運(yùn)轉(zhuǎn)動(dòng)……，猶鶻鳥之珠”，故稱之為“鶻眼凝珠”［18］。病因病機(jī)可歸納為情志內(nèi)傷，肝郁化火，上犯于目，使目眶脈絡(luò)澀滯所致；素體陰虛，或邪熱亢盛，日久傷陰，或勞傷過度，耗傷陰血，心血虧虛，肝陰受損，陰虛陽(yáng)亢，上犯目竅；七情內(nèi)傷，肝失疏泄，肝木乘脾，脾失健運(yùn)，氣機(jī)阻滯，血性不暢為瘀，津液凝聚為痰，痰瘀互結(jié)，阻于眶內(nèi)。因其病理特點(diǎn)是本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)兼雜，故臨床證型多變。常見證型有肝郁脾虛、肝郁火旺、痰瘀互結(jié)、氣陰兩虛、肝腎陰虛型等，常采用疏肝健脾、清肝瀉火、化痰散瘀、益氣養(yǎng)陰、滋補(bǔ)肝腎之法，常用方劑有逍遙散、參苓白術(shù)散、龍膽瀉肝湯、雙合湯、生脈飲、杞菊地黃丸、石斛夜光丸，以及針刺療法［19-21］。

3.3 平突散系列復(fù)方治療TAO分析 燕樹勛教授根據(jù)TAO目前西醫(yī)研究機(jī)制及中醫(yī)病因病機(jī)，結(jié)合自己多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為RFs細(xì)胞因子表型可能與中醫(yī)證型呈對(duì)應(yīng)關(guān)系：即早期細(xì)胞因子表現(xiàn)為Th1型細(xì)胞因子，中醫(yī)辨證為標(biāo)實(shí)，以肝火旺盛為主，痰瘀互結(jié)為輔，以清肝瀉火為法，佐加活血化痰之藥，瀉火平突散治之。中期以Th0型細(xì)胞因子為主，中醫(yī)辨證為由標(biāo)實(shí)向本虛過度，以標(biāo)實(shí)為主，為痰瘀互結(jié)證，以化痰散瘀為法，活血平突散治之。晚期細(xì)胞因子表現(xiàn)為Th2時(shí)，中醫(yī)辨證為本虛標(biāo)實(shí)，以本虛為主，為肝腎陰虛證，痰瘀互結(jié)，以滋肝益腎、化痰祛瘀為法，養(yǎng)目平突散治之。

瀉火平突散中龍膽草味苦，性寒，歸肝、膽經(jīng)，有清瀉肝膽實(shí)火之功，夏枯草為清肝火、散郁結(jié)的要藥，二者共奏清瀉肝經(jīng)實(shí)火之功而為君藥。黃芩有清熱燥濕，解毒功效；青黛清熱解毒，涼血；青葙子清肝明目，退翳；菊花發(fā)散風(fēng)熱，清肝明目，平抑肝陽(yáng)；白蒺藜平肝疏肝，祛風(fēng)明目。這五味藥既能助君藥清肝火之功，又有明目之效，共為臣藥。黃藥子解毒消腫、化痰散結(jié)消癭、涼血止血；梔子涼血解毒；赤芍清熱涼血、散瘀止痛；牡丹皮清熱涼血、活血化瘀。這三味藥共奏活血化瘀散結(jié)消癭之功，補(bǔ)充君臣之藥效不足，共為佐使之藥?；钛酵簧⒅谐嗌挚辔⒑?，歸肝經(jīng)，有清熱涼血，散瘀止痛之功；澤蘭活血祛瘀消癰；三棱破血行氣；穿山甲活血消癥之要藥。這四味共為君藥，以發(fā)揮活血散瘀之功。牡蠣平肝潛陽(yáng)，軟堅(jiān)散結(jié)；鱉甲咸，寒，滋陰潛陽(yáng)，軟堅(jiān)散結(jié)；浙貝苦寒，清熱化痰，解毒散結(jié)消癰；玄參清熱涼血，滋陰瀉火，解毒散結(jié)；牡蠣、鱉甲、貝母配玄參共為臣藥，共奏散結(jié)消腫、養(yǎng)陰清熱之功，在活血散結(jié)的同時(shí)而不傷陰。黃藥子化痰散結(jié)消癭，清熱涼血解毒；山慈菇清熱解毒，化痰散結(jié)，二者共為佐藥，輔助君臣藥之藥效的發(fā)揮。澤瀉淡滲利濕為使藥，使邪有出路，利水而不傷陰；養(yǎng)目平突散中旱蓮草滋補(bǔ)肝腎；女貞子補(bǔ)益肝腎，明目；熟地補(bǔ)血養(yǎng)陰，填精益髓；此三者為君藥，共奏補(bǔ)益肝腎之功。白芥子豁痰散結(jié)；鱉甲、牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)；浙貝清熱化痰、散結(jié)消癰，玄參涼血散結(jié)；此共為臣藥，主化痰散結(jié)之效，與君藥共奏標(biāo)本兼治之法。茺蔚子清肝明目；丹皮清熱化瘀；白芍?jǐn)筷幰指?；莪術(shù)破血行氣，此共為佐藥，兼顧清熱化瘀斂陰之法。方中各味中藥協(xié)同發(fā)揮作用而達(dá)到治療效果。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，平突散系列復(fù)方能夠通過增強(qiáng) MMP 的活性，抑制 TIMP 的活性，調(diào)節(jié)MMP/TIMP的動(dòng)態(tài)平衡，從而減少CD40L刺激后RFs的ECM合成。三種中藥復(fù)方中養(yǎng)目平突散效果最佳，原因可能是CD40L引起T細(xì)胞依賴的B細(xì)胞活化，使Th1/Th2功能失衡，Th1向Th2轉(zhuǎn)化，促使大量的Th2型細(xì)胞因子分泌，引起體液免疫應(yīng)答，疾病趨于靜止期，這正與養(yǎng)目平突散對(duì)應(yīng)的疾病期一致。

4 問題與展望

TAO病機(jī)復(fù)雜，目前西醫(yī)已從不同角度對(duì)TAO的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究。但就目前來看，TAO的發(fā)病機(jī)制仍不完全明了。中醫(yī)藥與西醫(yī)治療相比，其優(yōu)勢(shì)在于應(yīng)用領(lǐng)域廣泛、無明顯不良反應(yīng)以及療效確切等。但是在目前的醫(yī)學(xué)研究中，中醫(yī)藥治療TAO尚缺乏從共刺激信號(hào)通路方面對(duì)其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究及臨床研究。通過辨證論治，配合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)來研究其機(jī)制，不僅能完善TAO的治療方法，而且能夠推動(dòng)中醫(yī)藥在世界舞臺(tái)的發(fā)展進(jìn)程。

本文不足：

由于甲狀腺相關(guān)型眼?。═AO）發(fā)病機(jī)制尚不清楚，國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者均在嘗試通過各種方法對(duì)其進(jìn)行治療，但在共刺激信號(hào)通路方面探討中藥對(duì)TAO治療的研究相對(duì)較少。需要進(jìn)一步以CD40-CD40L共刺激信號(hào)通路為切入點(diǎn)，深入探討中藥治療TAO 的作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：燕樹勛進(jìn)行研究的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；崔亞萍、余丹丹負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)施，資料收集整理；萬紅撰寫論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；陳亞琳進(jìn)行論文的修訂、英文的修訂；燕樹勛進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。