呼吸道合胞病毒非結(jié)構(gòu)蛋白1感染對(duì)A549細(xì)胞let-7c-5p及miR-122-5p表達(dá)的影響

曾冬新 馮淑文 王壽懿 趙東赤

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是兒童感染最常見(jiàn)的病原體，大多數(shù)嬰兒在出生后兩年內(nèi)至少感染一次RSV，導(dǎo)致每年約300萬(wàn)患兒住院治療和11.8萬(wàn) 5歲以下的兒童死亡［1，2］。RSV感染主要局限在呼吸道，病毒復(fù)制引起炎癥細(xì)胞的聚集，釋放炎癥因子，導(dǎo)致氣道平滑肌水腫，氣道阻塞，氣道高反應(yīng)性，臨床表現(xiàn)為毛細(xì)支氣管炎及喘息［3-4］。RSV基因組由單股副鏈RNA組成，全長(zhǎng)約15 KB，包含10個(gè)編碼區(qū)，共編碼11種蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白NS1蛋白基因組全長(zhǎng)531 bp，共編碼139個(gè)氨基酸，分子量為（17.5±2.1）KD［5］。NS1是抑制宿主產(chǎn)生抗病毒反應(yīng)的主要成分：通過(guò)激活 NF-κB及磷酸化蛋白激酶AKT、抑制腫瘤壞死因子、上調(diào)抗凋亡基因bcl-2、下調(diào)凋亡基因bax等途徑抑制細(xì)胞凋亡來(lái)促進(jìn)病毒復(fù)制［6，7］；抑制Ⅰ型干擾素的作用，拮抗宿主天然免疫反應(yīng)，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖及作用，拮抗宿主獲得性免疫應(yīng)答［8，9］。由于缺乏經(jīng)驗(yàn)證的安全有效的疫苗及抗病毒藥物，RSV依然是人類健康所面臨的重要挑戰(zhàn)，了解病毒蛋白對(duì)宿主的抗病毒反應(yīng)的機(jī)制對(duì)制定新的抗病毒干預(yù)措施是至關(guān)重要的。

微小RNA（microRNAs/miRNAs）是一種小分子的非編碼RNA，成熟的miRNAs長(zhǎng)度大約為20個(gè)核苷酸，它通過(guò)與目的基因的3′端非編碼區(qū)，或目的信使RNA的5′端非編碼區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)，最終抑制信使RNA的轉(zhuǎn)錄或使之降解，在基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)［10，11］。miRNA參與了感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展，甚至由此引起相關(guān)腫瘤疾病。病原體感染后可引起機(jī)體一系列的變化，譬如，病毒可以通過(guò)宿主miRNA來(lái)調(diào)節(jié)病毒周期及宿主細(xì)胞的內(nèi)壞境，以利于其生存；宿主的miRNA也可以反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)。研究證實(shí)，RSV通過(guò)調(diào)節(jié)宿主miRNA的表達(dá)來(lái)影響宿主抗病毒免疫應(yīng)答［12］。我們前期通過(guò)基因芯片研究了RSV感染兒童外周血miRNAs表達(dá)的變化，篩選出表達(dá)具有顯著差異的miRNAs，包括 miR-106b-5p，miR-20b-5p，miR-342-3p，miR-877-5p，miR-122-5p，miR-320d和 let-7c-5p，其中以let-7c-5p及miR-122-5p表達(dá)差異性最為明顯［13］。本研究通過(guò)進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)向A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染呼吸道合胞病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1重組質(zhì)粒（pNS1）來(lái)構(gòu)建體外NS1感染模型，進(jìn)一步明確NS1對(duì)宿主let-7c-5p及miR-122-5p的調(diào)節(jié)，了解病毒跟宿主相互作用，為臨床治療RSV感染提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器 人肺腺癌細(xì)胞A549由武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心保存，RSV NS1重組質(zhì)粒（pNS1-flag）由本實(shí)驗(yàn)室保存，高糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（Sepro），RNA提取液（Servicebio），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Rox）熒光定量 PCR試劑盒（Roche），ViaFectTM Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑（Promega）。三氣培養(yǎng)箱（Panasonic，MCO-170MUVL），倒置顯微鏡（Olympus，IX73），生物安全柜（Thermo Fisher，1300系列A2），全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（invitrogen，CountessTM II FL），實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀（Bio-Red，CFX ConnectTM）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) A549細(xì)胞使用10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素/鏈霉素）+高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)用0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2NS1重組質(zhì)粒/空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549 12孔板每孔轉(zhuǎn)染1 ug DNA，DNA：ViaFectTMTransfection Reagent=1μg：3μl。NS1重組質(zhì)粒組（pNS1組）轉(zhuǎn)染NS1重組質(zhì)粒，空載質(zhì)粒組（vector組）轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒。前一天以5×105個(gè)/孔的密度將A549細(xì)胞接種于12孔板中，使用10%胎牛血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合時(shí)進(jìn)行進(jìn)行轉(zhuǎn)染。操作按照ViaFectTMTransfection Reagent說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24 h及72 h后收集細(xì)胞。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè)miRNAs表達(dá) 收集各組細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，nanodrop2000測(cè)量RNA濃度及純度。以1μg總RNA為模板，采用莖環(huán)法合成cDNA第一鏈，以1μL cDNA第一鏈為模板，10 μmol/L的miRNA通用檢測(cè)引物和miRNA特異性反應(yīng)引物各 0.5μL，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master10μl，去核酸酶水8μL，用qPCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因let-7c-5p、miR-122-5p，用 GAPDH作為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，融合曲線分析60℃到95℃。各組數(shù)據(jù)與GAPDH進(jìn)行相對(duì)定量后均與相應(yīng)時(shí)段的對(duì)照組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較分析，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。qRTPCR所用引物見(jiàn)表1。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 qRT-PCR所需的引物序列

2 結(jié)果

2.1miRNAs的異常表達(dá) pNS1或空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞24及72 h后提取總RNA進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果提示，pNS1感染后24 h較空載質(zhì)粒組let-7c-5p的表達(dá)增高，而miR-122-5p的表達(dá)則降低，72 h較24 h時(shí)作用效果更明顯（見(jiàn)圖1）。

2.2靶基因預(yù)測(cè) 采用下列10種生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè) 靶 基：DIANAmT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22、Targetscan，進(jìn)行l(wèi)et-7c-5p及miR-122b-5p的靶基因預(yù)測(cè)，上述10個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件中交集最高的部分預(yù)測(cè)靶基因見(jiàn)表2、3。

圖1 miRNAs的異常表達(dá)

表2 let-7c-5p的部分預(yù)測(cè)靶基因

表3 let-7c-5p的部分預(yù)測(cè)靶基因

2.3預(yù)測(cè)靶基因GO功能富集 選取上述10個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件中l(wèi)et-7c-5p及miR-122b-5p的預(yù)測(cè)靶基因中交集最高的前3000個(gè)靶基因進(jìn)一步進(jìn)行GO生物學(xué)過(guò)程功能富集。結(jié)果顯示，let-7c-5p生物學(xué)過(guò)程功能富集于離子輸運(yùn)的正調(diào)節(jié)、嘧啶核苷酸合成及代謝過(guò)程、亮氨酸代謝過(guò)程、DNA分解過(guò)程、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞凋亡；miR-122b-5p生物學(xué)過(guò)程功能富集于正向調(diào)控趨化、蛋白質(zhì)氨基酸糖基化、磷酸代謝過(guò)程、核質(zhì)運(yùn)輸?shù)恼{(diào)控、對(duì)外部刺激反應(yīng)的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄、正向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、RNA代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)。見(jiàn)表4、5。

2.4預(yù)測(cè)靶基因功能分析 選取上述10個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件中l(wèi)et-7c-5p及miR-122b-5p的預(yù)測(cè)靶基因中交集最高的前3000個(gè)靶基因進(jìn)一步進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析。結(jié)果顯示，let-7c-5p的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要富集于嘧啶代謝；miR-122b-5p靶基因集合的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要富集于內(nèi)吞作用、黏著斑、白細(xì)胞遷移、腫瘤信號(hào)通路、硫酸角質(zhì)素生物合成、凋亡、MAPK信號(hào)通路。見(jiàn)表6、7。

表4 let-7c-5p預(yù)測(cè)靶基因的生物學(xué)過(guò)程

表5 miR-122-5p預(yù)測(cè)靶基因的生物學(xué)過(guò)程

3 討論

我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)NS1感染A549細(xì)胞可上調(diào)let-7c-5p、下調(diào)miR-122-5p的表達(dá)，與此前研究的RSV感染兒童外周血中l(wèi)et-7c-5p、miR-122-5p均下調(diào)不太一致，其原因可能是因?yàn)橥庵苎衛(wèi)et-7c-5p、miR-122-5p的水平是人體綜合作用的結(jié)果，與機(jī)體的反饋及負(fù)反饋息息相關(guān)。RSV感染可觸發(fā)宿主的天然免疫反應(yīng)，導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡：通過(guò)誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β，激活TGF-β依賴的SMAD-2/3信號(hào)通路，促進(jìn)自噬作用［14］；通過(guò)激活 NF-κB、JAK/STAT信號(hào)通路促進(jìn)趨化因子及炎癥因子的產(chǎn)生、募集固有免疫細(xì)胞拮抗病毒［15］；晚期則通過(guò)TGF-β信號(hào)通路誘導(dǎo)Th17細(xì)胞、Th9細(xì)胞和CD4 CTL樣效應(yīng)細(xì)胞來(lái)增強(qiáng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答［16］。RSV非結(jié)構(gòu)蛋白NS1則通過(guò)PI3K激活A(yù)TK，AKT直接磷酸化使調(diào)亡相關(guān)因子BAD及Caspase失活，激活NF-κB等途徑抑制細(xì)胞調(diào)亡，miR-122-5p參與此過(guò)程。NS1還可蛋白抑制Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞的增殖和活化，促進(jìn)Th2的增值和活化［17］，該過(guò)程涉及T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路，是RSV感染導(dǎo)致慢性氣道炎癥的病理基礎(chǔ)，miR-122-5p參與此過(guò)程。let-7c-5p的預(yù)測(cè)靶基因ABCB9編碼的膜相關(guān)蛋白是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的成員，參與抗原的提呈［18］；BAX基因編碼的蛋白屬于BCL2蛋白家族，其作為抗或促凋亡的調(diào)節(jié)因子參與多種細(xì)胞活動(dòng)［19］；IL2、IL3基因編碼的蛋白質(zhì)是一種強(qiáng)有力的促生長(zhǎng)細(xì)胞因子，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)。RSV感染所致的細(xì)支氣管炎兒童的肺泡灌洗液中IL3異常增高，其水平與患兒以后生活中反復(fù)喘息的發(fā)展直接相關(guān)［20］。RSV感染導(dǎo)致的喘息發(fā)病機(jī)制假說(shuō)中，RSV感染作為誘發(fā)因素，通過(guò)miRNA增加炎性介質(zhì)的合成以及提高氣道平滑肌白三烯合成酶活性及白三烯受體表達(dá)量，增強(qiáng)呼吸道平滑肌對(duì)炎性介質(zhì)的反應(yīng)強(qiáng)度，并通過(guò)miRNAs外泌體調(diào)節(jié)胸腺淋巴細(xì)胞的分化和功能改變，上調(diào)Th2樣細(xì)胞分化，抑制免疫耐受，提高機(jī)體對(duì)過(guò)敏原的敏感性［21］。結(jié)合let-7c-5p生物學(xué)過(guò)程功能富集于離子輸運(yùn)的正調(diào)節(jié)、嘧啶核苷酸合成及代謝過(guò)程、亮氨酸代謝過(guò)程、DNA分解過(guò)程、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞凋亡，miR-122b-5p信號(hào)通路富集于內(nèi)吞作用、黏著斑、白細(xì)胞遷移、調(diào)亡、MAPK信號(hào)通路，我們猜測(cè)RSV感染后通過(guò)NS1上調(diào)let-7c-5p，下調(diào)miR-122-5p的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡，逃逸細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)病毒復(fù)制，細(xì)胞因子釋放產(chǎn)生，氣道平滑肌反應(yīng)性增高，引起喘息及慢性氣道炎。

miRNAs在RSV感染后的氣道高反應(yīng)性形成中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控炎性程序、免疫細(xì)胞分化及功能、以及誘導(dǎo)免疫耐受下降，可能成為與RSV感染相關(guān)的兒童喘息及氣道炎的潛在預(yù)防和治療靶點(diǎn)。在本實(shí)驗(yàn)中，我們只選取了2個(gè)miRNA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及功能分析，結(jié)果多集中于let-7c-5p及miR-122-5p可能抑制宿主細(xì)胞的凋亡，抑制先天性或獲得性免疫應(yīng)答，有利于病毒增殖及有助于受感染細(xì)胞長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)。然而，實(shí)際上miRNA是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)上調(diào)表達(dá)或下調(diào)表達(dá)的miRNA都可能觸發(fā)其他功能相似或相反的miRNA的表達(dá)變化。因此，進(jìn)一步miRNA的特異性干預(yù)實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)行。