新型復合酶制劑在玉米淀粉加工中的應用

李義 俞峰 劉國棟 陶進 丁少明 曲音波 佟毅

摘 ?????要：傳統(tǒng)濕磨法玉米淀粉加工工藝是一“化學-機械”過程，即先用含亞硫酸浸泡液充分浸泡，再破碎分離提取其中的淀粉。受工藝原理的局限，濕基纖維中水分含量高且粘連大量淀粉，增加了整體工藝能耗，且降低了整體淀粉收率，具有大的改進空間。通過誘變及高通量篩選技術(shù)選育出特定酶系的高表達菌種，并進一步結(jié)合生產(chǎn)工藝采用復合酶復配技術(shù)，成功開發(fā)出一款高效的適用于玉米淀粉加工的復合酶制劑，可以降低濕基纖維的水分和總淀粉含量，降低了蒸發(fā)需要的能耗，同時提高了淀粉和蛋白收率。

關(guān) ?鍵 ?詞：玉米淀粉加工;纖維素酶;木聚糖酶;葡聚糖酶;高通量

中圖分類號：TS 234 ??????文獻標識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）08-1791-06

Abstract： Traditional wet milling technology for corn starch processing is a chemical-mechanical process， in which corn is fully steeped with sulfite-containing soaking liquid first， and then broken for the extraction of starch. Due to the limitations of the process principle， wet fiber has high water content and the adhesion of starch， which increases the energy consumption of the whole process， and reduces the overall yield of starch， thus having great room for improvement. In this article， through mutagenesis and high-throughput screening technology， strains of high expression of specific enzymes were obtained. Further， combined with the production process using the compound enzyme technology， an efficient compound enzyme preparation suitable for corn starch processing was successfully developed， which can reduce the wet fiber moisture and its total starch content， reduce the energy consumption of evaporation， and at the same time improve the starch and protein yields.

Key words： ?Corn starch processing; ?Cellulase; ?xylanase; ?Glucanase; ?High throughput

我國是世界第一大玉米淀粉生產(chǎn)大國。2018年，玉米淀粉總產(chǎn)量為2 815萬t，占淀粉總產(chǎn)量的93.5%，作為基礎(chǔ)原料廣泛應用于食品、飼料、醫(yī)藥、化工和能源等諸多領(lǐng)域，地位舉足輕重。傳統(tǒng)的玉米淀粉加工廠均采用亞硫酸浸泡、脫胚磨脫胚、針磨粉碎、分離洗滌工藝提取淀粉、蛋白、纖維皮、胚芽等產(chǎn)品的濕磨加工工藝。該工藝使用亞硫酸，對生產(chǎn)環(huán)境和自然環(huán)境有污染，且玉米含有的非淀粉多糖—木聚糖、β-葡聚糖、果膠等黏性物質(zhì)與淀粉有一定交聯(lián)，對淀粉加工過程有較大的影響，使?jié)衲スに嚥荒苡行У貜氐追蛛x出淀粉，造成纖維脫水難，纖維和胚芽殘留淀粉和蛋白高，影響淀粉的收率，并影響生產(chǎn)效率。

玉米淀粉的生產(chǎn)原料是玉米籽粒。玉米籽粒是一個果實，在植物學上稱為穎果。成熟的玉米籽粒由種皮、胚乳和胚三部分組成。玉米種子最外面的薄薄的皮層稱為種皮。種皮的成分主要是纖維素、半纖維素、果膠等，占種子重量的6%～8%，主要起保護種子的作用;靠近種皮內(nèi)部一層排列規(guī)則致密的細胞，里面包含有大量蛋白質(zhì)和淀粉，被稱為胚乳，一般占種子重量的80%～85%;胚位于種子基部，是種子最重要的組成部分，約占種子重量的10%～15%，就是未來發(fā)育成新植株的雛形。

酶技術(shù)目前已廣泛應用在玉米深加工行業(yè)的許多產(chǎn)品（葡萄糖漿、麥芽糖漿、高果糖漿、功能性低聚糖、發(fā)酵制品、蛋白飼料等）的生產(chǎn)環(huán)節(jié)中（淀粉液化、淀粉糖化、葡萄糖異構(gòu)、酒精發(fā)酵、蛋白水解等），并且在產(chǎn)品質(zhì)量、產(chǎn)品收率、生產(chǎn)成本（能耗、化學品消耗、儀器折舊）、生產(chǎn)的穩(wěn)定性和連續(xù)性的方面起著十分重要的作用。近年來，酶學技術(shù)不斷進步，發(fā)展日新月異。本文根據(jù)玉米籽粒的構(gòu)成和成分，以及植物纖維降解酶酶解原理[1，2]，篩選出適宜的纖維降解復合酶，開發(fā)出一款可有效降低纖維中水分和淀粉含量的復配酶制劑。

1 ?實驗部分

1.1 材料與試劑

1.1.1 ?材料

菌種：白銀賽諾公司產(chǎn)纖維素酶1#菌種;白銀賽諾公司產(chǎn)纖維素酶2#菌種;白銀賽諾公司產(chǎn)纖維素酶3#菌種。

酶制劑：里氏木霉產(chǎn)β-葡聚糖酶（酶活1 500萬U/g）;里氏木霉產(chǎn)木聚糖酶（酶活200萬U/g）。

實驗原料：玉米、濕基玉米纖維皮、玉米皮、玉米芯、麩皮、玉米漿。

1.1.2 ?試劑

乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色液、硫酸、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、木聚糖、-葡聚糖、亞硝基胍、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、葡萄糖等，均為化學純試劑。

1.2 ?儀器與設(shè)備

1.2.1 ?儀器

燒杯、容量瓶、玻璃棒等實驗室常用玻璃儀器。

1.2.2 ?設(shè)備

超凈工作臺、顯微鏡、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、高溫蒸汽滅菌鍋、磁力攪拌器、電子天平、離心機、酸度計、分光光度計、酶標儀、恒溫水浴鍋、蒸餾水器。

1.3 ?實驗方法

1.3.1 ?酶解濕基纖維皮去淀粉實驗選擇復配用纖維素酶

（1）酶制劑的應用條件

根據(jù)酶制劑應用原理，結(jié)合濕磨淀粉加工工藝，在不改變原工藝條件下使用酶制劑時，需要纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶等多種酶組分的協(xié)同配合。這些酶組分均需要符合如下條件：酶制劑最適使用溫度為45～50 ℃;酶制劑最適使用在45～50 ℃、pH=3.5～4.5條件下有較好的穩(wěn)定性;能夠大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)，有較低的生產(chǎn)成本，適用于淀粉加工行業(yè)。

賽諾公司生產(chǎn)纖維素酶的菌株有1#、2#、3#，酶的適用溫度范圍為30～60 ℃，適用pH范圍為3.0～6.0，其中耐酸性能1#>2#>3#，產(chǎn)酶性能2#>3#>1#。

（2）酶解濕基纖維皮去淀粉實驗方法

取濕基纖維50 g，放入200 mL pH=4.0蒸餾水中（最好用乳酸調(diào)節(jié)，或者用亞硫酸調(diào)），在50 ℃水浴鍋中加入纖維降解復合酶，按纖維皮濕重的0.1%添加，酶解30 min。酶解結(jié)束后，倒入80目的篩中過濾，濾液放入大于1 000 mL容器中，再用800 mL冷水沖洗篩上纖維，沖洗液和第二步的濾液合并一處。將合并后的濾液反復沖洗篩上纖維5次，取篩上纖維用紗布或絨布擠干水分，測水分、總淀粉含量、連接淀粉含量?？瞻撞患用笇φ找膊捎靡陨喜襟E。

（3）檢測方法

纖維素酶（濾紙酶、CMC-Na酶）、木聚糖酶、β-葡聚糖酶及淀粉含量檢測方法見參考文獻[3-6]。

1.3.2 ?1#產(chǎn)纖維素酶菌株誘變育種實驗方法

從產(chǎn)酶性能上進行對比，2#菌種產(chǎn)纖維素酶優(yōu)于1#菌種，但1#菌種所產(chǎn)酶系耐酸性能好于2#菌種，生產(chǎn)及能耗低于2#菌種，生產(chǎn)成本低。因此，采用中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司的ARTP（常壓室溫等離子體）誘變儀，并結(jié)合高通量篩選平臺篩選高產(chǎn)纖維素酶突變菌株[7]的方法，對1#菌株進行誘變篩選，使其產(chǎn)纖維素酶性能與2#菌種相當。

（1）實驗流程圖

流程圖如圖1所示。

（2）孢子懸浮液的制備

將1#菌種接入菌種保藏斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)86 h，活化2次，加入10 mL滅菌的生理鹽水洗脫孢子，過濾菌絲，置于含有PDA液態(tài)培養(yǎng)基和玻璃珠的三角瓶中，充分打散。30 ℃，150 r/min培養(yǎng)使孢子萌發(fā)，吸取孢子懸液于離心管中，使孢子濃度調(diào)整到106～107 CFU/mL作為誘變原液。

（3）ARTP誘變方法

利用ARTP（常壓室溫等離子體）誘變儀對菌株進行誘變。誘變時的工作氣體為高純氦氣。按照處理功率100 W，氦氣流量12 SLM，樣品與等離子體發(fā)生器出口距離2 mm，處理樣品為10 μL，分別按照0、30、60、90、120、150、210、240、270、300 s不同照射時間來處理孢子懸浮液，考察致死率。

對處理后的孢子懸液進行稀釋，取100 μL稀釋液在含有羧甲基纖維素鈉的篩選平板中進行涂板。每個照射時間做3個稀釋梯度，每個稀釋梯度做4個平行試驗，置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以0 min為空白對照，采用活菌計數(shù)法，確定致死曲線以及正突變率曲線。繪制致死曲線，在啟動了修復功能的“馬鞍型”曲線最低點確定下次誘變時間的參考值。根據(jù)變色圈大小和菌株生長速度，在平板上挑選單菌菌落點到初篩平板上。

（4）篩選方法

初篩：利用1#菌降解纖維素會在添加羧基纖維素鈉的平板上產(chǎn)生透明圈的原理。將經(jīng)過ARTP誘變儀誘變后篩選的菌落，轉(zhuǎn)移到含有羧基纖維素鈉的平板上，培養(yǎng)3 d，測定菌落周圍透明圈直徑（H）與菌落直徑的大?。―），以H/D比值來衡量菌株產(chǎn)纖維素酶的能力大小[8]。挑選比值較大的菌落進行純化并保存在斜面試管中。

二輪誘變：將初篩透明圈和菌落直徑比值較大且生長性能好的菌株進行斜面培養(yǎng)后制備孢子懸浮液，應用ARTP誘變儀再次誘變。采用上述相同的方法進行羧基纖維素鈉平板篩選，獲得10 000株誘變后菌株。

纖維素酶活定量檢測：采用12孔板對獲得的10 000株誘變后菌株進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用YPD，培養(yǎng)溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為700 r/min，周期為90 h。離心取上清，應用高通量平臺，采用國標NY/T 912-2004纖維素酶活測定方法，以羧甲基纖維素鈉作為底物檢測10 000株誘變后菌株產(chǎn)纖維素酶活性。篩選得到10株高產(chǎn)纖維素酶的突變菌株。

化學誘變：對ARTP誘變后獲得高產(chǎn)纖維素酶的10株1#菌突變菌株再進行化學誘變。將10株1#突變菌株斜面培養(yǎng)于30 ℃，培養(yǎng)86 h，按照上述方法制備孢子懸浮液。取10 mL孢子懸浮液，加入10 mL亞硝基胍（NTG，4 mg/mL），30 ℃恒溫震蕩處理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min后，適當稀釋，涂布于含有羧甲基纖維素鈉的篩選平板，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，活菌計數(shù)，計算致死率，篩選高產(chǎn)纖維素酶1#誘變菌株500株。

此外，將10株1#突變菌株斜面培養(yǎng)于30 ℃，培養(yǎng)86 h，按照上述方法制備孢子懸浮液。取16 mL pH值7.0的磷酸緩沖液、4 mL孢子懸浮液、0.2 mL硫酸二乙酯（DES）原液充分混合（DES的終體積分數(shù)為1%），30 ℃恒溫震蕩處理5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 min后，分別于1 mL處理液中加入0.5 mL 25% Na2S2O3溶液終止反應。適當稀釋后，涂布于含有羧甲基纖維素鈉的篩選平板，30 ℃培養(yǎng)3～4 d，活菌計數(shù)，計算致死率，篩選高產(chǎn)纖維素酶1#誘變菌株500株。

使用與上文相同的纖維素酶活定量檢測方法檢測1 000株誘變后菌株的產(chǎn)纖維素酶活性，篩選得到4～5株高產(chǎn)纖維素酶的1#突變菌株。

（5）纖維素酶活高通量檢測方法[9，10]

標準曲線制作：取一塊96孔PCR板，第一列和第二列為平行實驗組，第三列為對照組，在對照組加入40 μL 0.1 mol/L、pH=5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，然后再加入50 μL DNS試劑，在實驗組中分別加入20 μL濃度為0.1～0.7 mg/mL的葡萄糖標準溶液（由母液和乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制），然后加入20 μL去離子水和50 μL DNS試劑，將PCR板放入PCR儀中設(shè)置程序，95 ℃加熱5 min，最后將其轉(zhuǎn)入96孔酶標板中讀取OD540數(shù)值，然后以葡萄糖濃度為Y軸，OD值為X軸繪制標準曲線（R平方大于0.99方可使用，每次新配制DNS試劑均需要繪制標準曲線）。

樣品測定：取一塊96孔PCR板，第一列、第二列、第三列為平行實驗組，第四列為對照組，在平行實驗組和對照組均加入20 μL樣品，然后在對照組中加入50 μL DNS試劑，在實驗組和對照組中都加入20 μL羧甲基纖維素鈉溶液，將PCR板放入PCR儀中設(shè)置程序，37 ℃保溫2 h，取出在實驗組中加入50 μL DNS試劑，再次放入PCR儀中設(shè)置程序，95 ℃加熱5 min，最后將其轉(zhuǎn)入96孔酶標板中讀取OD540數(shù)值，并將實驗組數(shù)值取平均后減去對照組數(shù)值，代入標曲方程中，從而計算出酶活。

1.3.3 ?實驗室模擬濕磨玉米淀粉加工確定復配酶復配方案的實驗方法

（1）原料準備

稱取100 g 玉米粒放入250 mL錐形瓶中，同樣的樣品做3個。然后配制600 mL SO2含量為0.145%的亞硫酸溶液，將玉米粒與酸溶液按1∶2混勻。

（2） 浸泡

將3份樣品標號0、1、2，放入恒溫水浴鍋中進行浸泡，溫度調(diào)節(jié)到50 ℃，并用溫度計進行校對，浸泡時間45～50 h，對其進行間隔搖晃混勻。

（3）脫胚芽

將胚芽與胚乳使用手動進行剝離，然后用烘至恒重的鋁盒將胚芽放入105 ℃烘箱進行烘干。約4 h，烘至絕干后稱重。

（4） 研磨

將分離的胚乳放入研磨機中進行充分研磨，研磨至沒有明顯的顆粒物為止。

（5）酶解

用乳酸將研磨液pH調(diào)至4.0左右，稱取酶加入到研磨液中，空白加入相應的蒸餾水，攪拌均勻，50 ℃下反應30 min后取出。

（6）纖維分離

先用50目的篩子進行過濾，濾上物進行研磨后，再次過濾。然后換成200目的篩子，將濾上物和50目的過濾液再次進行過濾，提取其中的纖維。將濾上物纖維置于烘至恒重的鋁盒中于105 ℃烘箱中烘約4 h，烘至絕干后稱重。采用高速粉碎機將其粉碎，然后檢測干纖維中的總淀粉含量。

（7） 濾出液離心脫水

將濾出液平均置于三個離心瓶中，混勻后放入到高速旋轉(zhuǎn)器中，10 000 r/min離心10 min，除去上清液。

（8）蛋白分離

向3個離心瓶中倒入65%自配浸出溶液，料水比為2∶1，混溶后放入到高速旋轉(zhuǎn)器中，10 000 r/min離心10 min，然后分離上清液蛋白液。然后再溶解，再分離，共分離3次。將分離出的蛋白液放入離心瓶中中加水繼續(xù)旋流，分離其中的上清溶液，沉淀蛋白置于烘至恒重鋁盒使用105 ℃烘箱烘干（約4 h至絕干），稱重。將其進行粉碎后測定粗蛋白含量。

（9） 可溶蛋白分離

與上步驟一樣，只是將65%浸出溶液換為超純水，料水比為2∶1?；烊芎蠓湃氲礁咚傩D(zhuǎn)器中，10 000 r/min離心10 min，然后分離可溶蛋白。然后再溶解，再分離。共分離3次，水排放掉。淀粉加水溶解后放入器皿中自然沉淀，然后將上清液去掉，沉淀淀粉放入到烘箱中干燥（105 ℃，4 h），稱重。干燥后放入磨中打碎，測定其粗蛋白含量。

（10）水分、總淀粉含量、粗蛋白含量檢測方法

見參考文獻[6，11，12]。

2 ?結(jié)果與討論

2.1 ?酶解濕基纖維皮去淀粉實驗選擇復配用纖維素酶

經(jīng)過多次反復酶解洗滌纖維皮實驗，實驗結(jié)果如表1。從實驗數(shù)據(jù)分析，2#菌產(chǎn)纖維素酶對纖維洗滌效果最佳，其次為1#菌產(chǎn)纖維素酶，3#菌所產(chǎn)酶則幾乎沒有效果。

2.2 ?不同菌種來源纖維素酶組分分析

酶活分析結(jié)果顯示，除了主鏈降解酶系外，2#菌所產(chǎn)纖維素酶中木聚糖側(cè)鏈降解酶阿拉伯呋喃糖苷酶活力較高，可能對濕基纖維洗滌有重要影響（表2）。

2.2.1 ?纖維素酶生產(chǎn)菌株誘變育種實驗結(jié)果???經(jīng)過近半年的努力，以1#菌株為出發(fā)菌篩選出三支高產(chǎn)菌株，酶活基本與2#菌株酶活相近（表3）。

2.2.2 ?誘變菌所產(chǎn)纖維素酶的酶學性質(zhì)

三支高產(chǎn)菌株中，誘變菌1所產(chǎn)纖維素酶的溫度穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性良好（表4），符合濕磨淀粉加工的需求。

2.3 ?模擬濕磨玉米淀粉加工實驗復配酶制劑結(jié)果

當使用誘變菌1#所產(chǎn)纖維素酶進行酶解，添加量為0.1%時，應用效果良好。但酶制劑用量偏大，使用成本較高，需要將添加量控制在在0.01%以內(nèi)，才可以大量的應用于濕磨淀粉加工行業(yè)。因此，使用賽諾公司里氏木霉產(chǎn)200萬U/g木聚糖酶和里氏木霉產(chǎn)1 500萬U/g β-葡聚糖酶對其進行復配，可望再進一步提升使用效果，降低酶制劑使用成本。

2.3.1 ?不同用量纖維素酶添加實驗

分別取100 g玉米進行實驗室濕法加工工藝試驗，將上述誘變菌1#所產(chǎn)纖維素酶按照0.006%、0.009%、0.012%的梯度添加量在針磨工藝環(huán)節(jié)后添加，進行后續(xù)模擬實驗并進行理化分析，應用效果如圖2。

由圖2可知，隨著纖維素酶用量的增加，淀粉、蛋白等收率逐漸增加，但考慮到濕法分離效果可提升性及此纖維素酶生產(chǎn)經(jīng)濟成本問題，采用0.006%添加量纖維素酶與木聚糖酶、β-葡聚糖酶進行進一步復合試驗。

2.3.2 ?纖維素酶和木聚糖酶復配實驗

將0.006%添加量的上述纖維素酶與0.001%、0.002%、0.003%三種梯度添加量的木聚糖酶進行復配，采用上述相同實驗方法進行模擬實驗和理化分析，應用效果如圖3。

由圖3可以看出，隨著木聚糖酶添加量增加，淀粉收率增加緩慢，但蛋白收率等指標含量明顯增加。為進一步提升綜合分離效果，采用添加量為0.006%的纖維素酶、0.002%的木聚糖酶與β-葡聚糖酶進行后續(xù)復合試驗。

2.3.3纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶復配實驗

將0.006%的纖維素酶、0.002%木聚糖酶與0.001%、0.002%、0.003%梯度添加量的β-葡聚糖酶進行復配后，采用上述相同工藝實驗進行模擬和理化分析，應用效果如圖4。由圖4可知，β葡聚糖添加量達到0.002%后，各生產(chǎn)指標變化幅度減緩，達到穩(wěn)定有效分離效果。

2.4 ?復配酶作用效果驗證

綜合分析上述梯度添加量應用實驗數(shù)據(jù)，以誘變菌1#所產(chǎn)濾紙酶活為200 U/g的纖維素酶、賽諾公司里氏木霉產(chǎn)200萬U/g木聚糖酶和里氏木霉產(chǎn)1 500萬U/g β-葡聚糖酶按3∶1∶1的比例進行復配后，與不添加酶的樣品做對比實驗，應用效果如表5。

通過模擬實驗數(shù)據(jù)，復合酶可以降低纖維總淀粉含量3.4%，蛋白收率提高0.35%，淀粉收率提高1.98%，說明復合酶對提高濕磨加工玉米淀粉收率有良好效果。因?qū)嶒炇夷M實驗，有局限性，需要進行生產(chǎn)實驗，驗證實驗效果。

2.5 ?工廠放大驗證

在中糧集團某日加工2 000 t玉米淀粉生產(chǎn)線上進行為期一個月的中試生產(chǎn)實驗，試驗結(jié)果如圖5所示，驗證了復合酶在提高淀粉和蛋白收率、減少能源動力消耗方面的效果。

3 ?結(jié) 論

本文以玉米結(jié)構(gòu)組成與酶制劑作用原理為基礎(chǔ)，從菌種誘變和高通量篩選出發(fā)，獲得了適宜酶系的高表達菌株。進一步以此為基礎(chǔ)進行酶系的復配，開發(fā)出一款可應用于玉米淀粉濕磨工藝的專用酶制劑。大生產(chǎn)實驗數(shù)據(jù)表明，在無需添加較大生產(chǎn)裝置和對生產(chǎn)工藝進行較大改動的情況下，僅在纖維洗滌槽添加0.01%用量的該復合酶時，可有效降低濕基纖維水分4.11%，濕基纖維總淀粉含量下降3.6%，淀粉收率提高0.21%，蛋白收率提高0.27%，顯著提高了工藝的整體淀粉收率，并降低了能耗。

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