天麻基因組DNA不同提取方法比較

黎曉英 李俊威 劉勝貴 田玉橋 陳三春 方偉 鄒娟 邱小燕 伍賢進

摘要?以天麻塊莖為供試材料，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度含量測定技術(shù)，比較改良CTAB法和SDS-CTAB法提取天麻塊莖基因組 DNA 的效果。結(jié)果表明，改良CTAB 法提取天麻塊莖基因組 DNA的產(chǎn)量高于 SDS-CTAB法，純度略次于SDS-CTAB法，二者提取的基因組 DNA，DNA 結(jié)構(gòu)完整、大片段的 DNA 分子含量高。該研究為天麻基因組DNA提取方法的選擇提供了參考依據(jù)，為天麻種質(zhì)資源的分子遺傳研究奠定了一定的科學與技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?天麻;基因組 DNA;SDS-CTAB法;改良CTAB 法

中圖分類號?Q943文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0111-02

Abstract?Taking Gastrodia elata B1.tuber as material，agarose gel electrophoresis and ultraviolet spectrophotometry were used to compare the effects of improved CTAB and SDSCTAB on genomic DNA from rhizoma tuber of G.elata.The results showed that the yield of genomic DNA extracted from G.elata tubers by improved CTAB method was higher than that by SDSCTAB method，and the purity was slightly lower than that by SDSCTAB method.The results provided a reference for selecting genomic DNA extraction methods of G.elata and laid a scientific and technical foundation for the molecular genetic research of G.elata germplasm resources.

Key words?Gastrodia elata B1.;Genomic DNA;SDSCTAB method;Improved CTAB method

天麻為常用名貴中藥，是蘭科植物天麻（Gastrodia elata B1.）的莖塊，植株生長于海拔400～3 200 m的林下、林中空地、林邊緣及灌叢邊緣，為國家二級保護植物。其根莖入藥用以治療頭暈?zāi)垦?、肢體麻木、小兒驚風癲癇抽搐等癥，同時還具有刺激神經(jīng)系統(tǒng)、健腦、延緩衰老、增強機體免疫力和預(yù)防骨質(zhì)疏松等作用[1-2]。因天麻特殊的生物學特性——沒有一般植物所具有的葉片，加上含豐富的蛋白質(zhì)、較高的多糖和酚類、酶類及其他次生代謝物，使得其基因組DNA的提取比較困難。傳統(tǒng)的提取方法常常導(dǎo)致基因組DNA產(chǎn)量過低、雜質(zhì)較多、DNA不純、質(zhì)量較難控制等許多問題，提取物僅可滿足普通的分子生物學試驗分析的需要，因此眾多學者對中藥材基因組DNA提取方法進行過探討[3-5]。關(guān)萍等[6] 對天麻基因組 DNA 提取方法進行了比較研究，認為SDS-CTAB 法是較理想的提取方法;張弦等[7]證明SDS-CTAB法提取DNA完整、純度高、重復(fù)性好;程紀倫等[8]應(yīng)用CTAB 法和改良的CTAB法提取天麻基因組 DNA，結(jié)果表明改良 CTAB 法提取的天麻基因組 DNA 產(chǎn)量高、純度高。但是，提取天麻基因組DNA究竟采用改良 CTAB 法效果好還是SDS-CTAB法好，還有待考證。

基于天麻基因組DNA提取方法的研究現(xiàn)狀，筆者將應(yīng)用改良 CTAB 法和SDS-CTAB法對天麻基因組DNA提取效果進行比較研究。

1?材料與方法

1.1?材料?供試天麻為采集于湖北、陜西等地區(qū)的新鮮天麻，由湖南省博世康中醫(yī)藥有限公司提供。

1.2?主要試劑

1.2.1?改良 CTAB 法主要試劑。CTAB，氯仿∶異戊醇（24∶1），RNase A，異丙醇，無水乙醇，TE。

1.2.2?SDS-CTAB法主要試劑。

β-巰基乙醇，蛋白酶K，SDS， CTAB，氯仿∶異戊醇（24∶1），RNase A，NaAc，無水乙醇， TE。

1.3?方法

1.3.1?改良 CTAB 法。

取天麻細小塊狀物約0.5 g放入研缽中，加入1 mL預(yù)熱的 CTAB提取液，研磨;將細粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL的Eppendorf管中，再加CTAB提取液至1.5 mL，置于65 ℃水浴中保溫1 h;從水浴中取出離心管，冷卻至室溫，再12 000 r/min離心10 min，然后吸取上清液放至另一干凈已滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，同時加入同樣體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），輕緩顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min，然后吸取上清液放至另一干凈已滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，同時加入同樣體積的異丙醇，混勻，放置在-20 ℃冰箱中60 min;12 000 r/min離心15 min獲得DNA沉淀，70%乙醇洗2次，沉淀自然干燥;加入30 μL TE緩沖液或者去離子水（含有10 μg/mL RNase A）溶解DNA，并貯存在4 ℃冰箱中。

1.3.2?SDS-CTAB法。

將1.5 mL的Eppendorf管中裝70 μL β-巰基乙醇，置于-20 ℃冰箱中預(yù)冷，取天麻細小塊狀物約0.5 g，置于預(yù)冷的離心管中，同時快速加入40 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混合;加入56 ℃預(yù)熱SDS 700 μL，混勻， 56 ℃水浴120?min，然后取出，冷卻至室溫，加入1/2體積100 g/L CTAB，56 ℃水浴30?min，取出，冷卻至室溫，再12 000 r/min離心10 min，然后吸取上清液放至另一干凈已滅菌的1.5 mL Eppendorf管中，同時加入同樣體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），混合30 min，12 000 r/min離心12 min，取上清液重復(fù)操作一次。取上清液至另一無菌Eppendorf管中，加入-20 ℃預(yù)冷的1/10體積3 mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，置-20 ℃冰箱中沉淀60 min，12 000 r/min離心10 min。用70%冷乙醇洗滌沉淀2次，每次12 000 r/min離心10 min，沉淀自然干燥;加入30 μL TE緩沖液或者去離子水（含有10 μg/mL RNase A）溶解DNA，并貯存在4 ℃冰箱中。

1.4?基因組DNA的電泳檢測

1.4.1?配制 1%瓊脂糖凝膠。

用電子天平稱取瓊脂糖粉1 000 mg，置于錐形瓶中，加入1×TBE溶液100 mL，充分搖勻，將該錐形瓶直接加熱至TBE溶液沸騰，煮沸20 s，視覺判斷瓊脂糖粉完全溶解，取出加入一滴EB（約20 μL），緩慢搖勻后，自然降溫至55 ℃左右（以不燙手背為宜）。然后，放置好制膠器，插好擋板，按要求在固定處放好梳子，再將溶液緩緩倒入膠槽，室溫下放置1 h左右，待凝膠冷卻凝固后，輕輕移去梳子，去掉擋板，將凝膠板置于含有TBE緩沖液的水平電泳槽中。

1.4.2?上樣。取2 μL上述2種方法提取的DNA混入少量的溴酚藍（大約是樣品量的1/10），混勻后全部點入梳子孔內(nèi)，注意留出第一孔位置加入等量的DNA分子量標記。

1.4.3?恒壓電泳。

接通電源后，調(diào)節(jié)電壓至100 V，啟動電泳，恒壓電泳1.5～2.0 h，根據(jù)溴酚藍距離點樣孔的位置來判斷電泳進程。

1.4.4?拍照。將凝膠從凝膠板上取下，采用凝膠成像儀拍照。

1.5?DNA的紫外檢測

蛋白質(zhì)的最大吸收波長為280 nm，核苷酸為 260 nm，測波長分別為 260、280 nm 時的 OD 值進行比較，分析DNA的濃度和純度。先用2 mL雙蒸水校正紫外分光光度計的零點，用微量移液器取DNA樣品2 μL，加雙蒸水稀釋10倍并充分混勻后，全部轉(zhuǎn)入專用比色皿中，分別讀出其在不同波長下的OD值，然后計算DNA樣品的濃度。DNA樣品濃度（μg/μL）=OD260×核酸稀釋濃度×50/1 000。

2?結(jié)果與分析

2.1?改良 CTAB 法提取的天麻基因組DNA產(chǎn)量及純度分析

2.1.1?基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

運用改良 CTAB 法提取的天麻基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，DNA條帶亮度高，無明顯雜帶。

2.1.2?DNA產(chǎn)量及純度分析。該方法提取 DNA的OD260/OD280比值為 1.756，<1.8，表明 DNA 中存在少量的雜質(zhì);根據(jù) OD260計算所提取的 DNA 濃度為 1.513 μg/μL。

2.2?SDS-CTAB 法提取的天麻基因組DNA產(chǎn)量及純度分析

2.2.1?基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

運用SDS-CTAB 法提取天麻基因組DNA后，取樣2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2，DNA條帶亮度好，無雜帶。

2.2.2?DNA產(chǎn)量及純度分析。

該法提取 DNA的OD260/OD280比值為1.822，接近1.80，表明 DNA純度比較高，污染比較少;根據(jù) OD260計算所提取的天麻基因組 DNA 濃度為 1.296 μg/μL。

3?討論

2種方法提取的天麻基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，改良 CTAB 法的條帶亮度明顯優(yōu)于SDS-CTAB法。SDS-CTAB法使用了β-巰基乙醇、蛋白酶K、SDS，這些試劑的共同作用均可分解蛋白質(zhì)，便于DNA解離，但是β-巰基乙醇為高毒試劑，且氣味難聞。SDS-CTAB法耗時較改良 CTAB 法長，操作步驟較多，操作過程難免造成DNA損失。因此，SDS-CTAB法得到的DNA純度比改良 CTAB 法高，產(chǎn)量比改良 CTAB 法低。

天麻塊莖多糖類和酚類物質(zhì)的含量相當高，在試驗中有效篩選和改進不同的基因組DNA的提取方法對獲得高質(zhì)量的基因組DNA十分重要，也是對天麻物種進行分子生物學研究的重要前提[9]。通過改良CTAB法和SDS-CTAB法提取天麻基因組DNA的比較研究表明，改良CTAB法提取天麻塊莖基因組DNA的產(chǎn)量優(yōu)于SDS-CTAB法，雖然改良CTAB法提取的DNA純度略差，但是二者提取的 DNA 片段完整無斷裂，主要原因是2種方法都使用了CTAB，CTAB具有從大量產(chǎn)生黏多糖的有機體中制備純化DNA的特性。CTAB屬于一種帶陽離子的表面活性劑，具有較好的化學特性，即在溶液中離子強度低的情況下，可以沉淀核酸和酸性多聚糖，在溶液中離子強度高的情況下，CTAB與蛋白質(zhì)和非酸性多聚糖形成復(fù)合物而不能沉淀DNA和RNA[10]。提取基因DNA必須考慮后續(xù)的分子生物學研究，傾向于選擇無雜質(zhì)且DNA 片段完整的提取方法。

在天麻塊莖基因組DNA提取過程中務(wù)必始終注意以下幾點：①研缽、吸頭、配制的試劑要按照要求進行滅菌，運用SDS-CTAB法時，研缽和部分試劑要在低溫冰箱中預(yù)冷，盡可能地減少外來污染和DNA 降解;②研磨材料的力度應(yīng)該適當，太小造成細胞破裂不充分，影響DNA得率，過大可能損壞DNA分子，所以在整個研磨過程中，應(yīng)該保持用力均勻且方向一致;③操作過程避免劇烈振蕩，以減少DNA斷裂，動作盡量溫和，保持DNA完整;④操作要規(guī)范，在制備瓊脂糖凝膠時要避免產(chǎn)生氣泡，上樣電泳時移液器吸頭不能插入膠中或劃破膠孔，電泳時先高電壓再低電壓;⑤紫外分光光度計測定 DNA 樣品時，使用TE 緩沖液作為溶解 DNA 的溶液比較好，是由于TE 緩沖液保持了低離子濃度，可以保證讀數(shù)準確。

參考文獻

[1] 袁崇文.中國天麻[M].貴陽：貴州科技出版社，2002.

[2] 周鉉，楊興華，梁漢興，等.天麻形態(tài)學[M].北京： 科學出版社，1987.

[3] 徐昌艷，雷丹丹，曹旭林，等.天冬藥材基因組DNA提取方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2019，47（8）：171-173.

[4] 方強強，王燕.巖陀DNA提取方法研究[J].井岡山大學學報（自然科學版），2019，40（2）：19-24.

[5] 陳力群，譚晴晴，陳雪燕，等.桑黃基因組DNA提取方法優(yōu)化及分子鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2019，51（1）：18-21，31.

[6] 關(guān)萍，康冀川，鄒容，等.蘭科植物天麻基因組 DNA 提取方法的比較研究[J].山地農(nóng)業(yè)生物學報，2004，23（5）：422-425.

[7] 張弦，張小蕾.天麻基因組DNA提取方法的選擇和優(yōu)化[J].吉林醫(yī)學，2010，31（9）：1219.

[8] 程紀倫，范愛輝，陳琦.高質(zhì)量天麻基因組 DNA 的提取[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2009（8）：153-155.

[9] 陳宗禮，陳昱宇，王睿婷，等.組培棗苗基因組DNA提取方法及其含量的比較[J].基因組學與應(yīng)用生物學，2011，30（1）：110-116.

[10] 魏群.分子生物學試驗指導(dǎo) [M].北京：高等教育出版社，1999.