河豚毒素在半褶織紋螺體內(nèi)富集和消除的研究

陳頁 張小軍 曾軍杰 嚴忠雍 宗靖靖

摘要?以有毒的河豚魚肝臟和無毒蝦肉飼喂半褶織紋螺，定期取樣，通過免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析織紋螺體內(nèi)河豚毒素含量的變化。結(jié)果表明，半褶織紋螺對河豚毒素的耐受力高，投喂有毒河豚魚肝臟后，其體內(nèi)毒素含量迅速增加。當投喂無毒蝦肉后，其體內(nèi)的河豚毒素初期會呈現(xiàn)減少趨勢，此后又快速增加。處理組和對照組幾乎在同一時間段內(nèi)出現(xiàn)毒素升高。因此，推斷半褶織紋螺能自身產(chǎn)生河豚毒素，也能從食物鏈獲得河豚毒素。

關鍵詞?織紋螺;河豚毒素;富集;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）

中圖分類號?S917.4文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0097-03

Abstract?The common snails of Nassarius semiplicatus were fed with toxic pufferfish liver and nontoxic shrimp meat in laboratory environment.The samples were taken regularly to analyze the changes of TTX content by UPLCMS/MS based on immunoaffinity column （IAC） purification.The results showed that Nassarius semiplicatus had high tolerance to toxin.After feeding toxic puffer fish liver，the toxin content in the body increased rapidly.When the nontoxic shrimp meat was fed，the accumulated TTX tended to decrease initially，but then the toxin content increased rapidly.In the same time period，there was an increase of toxin in the treatment group and the control group.Therefore it could be hypothesized that TTX in Nassarius semiplicatus might be produced by themselves.At the same time，Nassarius semiplicatus could enrich TTX through the food chain.

Key words?Nassarius spp.;Tetrodotoxin;Enrichment;UPLCMS/MS

織紋螺（Nassarius spp.）是一類海洋腹足類動物，是沿海地區(qū)常見的螺種，大多生活在潮間帶灘涂上，腐食性，在我國從南到北都有分布，主要在浙江、江蘇、廣東、福建一帶，其中最常見的是半褶織紋螺（Nassarius semiplicatus）。調(diào)查顯示，我國東南沿?？椉y螺按帶毒情況大致分為無毒織紋螺、有毒織紋螺和季節(jié)性有毒織紋螺[1]3類，如圖1所示。

我國沿海部分地區(qū)居民因食用織紋螺中毒事件時有發(fā)生，甚至出現(xiàn)人員死亡[2]。由于織紋螺食物中毒死亡率高，規(guī)模大，范圍廣，2012年國家衛(wèi)生健康委員會《關于預防織紋螺食物中毒的公告》已明令禁止銷售、經(jīng)營和食用織紋螺。目前已有大量研究表明織紋螺的主要致毒成分為河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）及其衍生物[3-6]。

關于織紋螺體內(nèi)河豚毒素來源一直存在爭議，主要分為外源性和內(nèi)源性，其中外源性分為食物鏈來源與微生物起源。織紋螺是腐食性動物，可能攝食了環(huán)境中有毒動物尸體或有毒藻類，導致毒素在體內(nèi)蓄積。此外，也有研究表明織紋螺體內(nèi)及其生活環(huán)境中均能分離培養(yǎng)出產(chǎn)生河豚毒素的細菌，但這些細菌的毒素含量很低，可能與毒素的產(chǎn)生或累積關系不大[7]，或是并非所有細菌都能在實驗室條件下培養(yǎng);內(nèi)源性來源可能是織紋螺像有些特定物種一樣能夠自身產(chǎn)生河豚毒素[8-9]。研究表明，攜帶河豚毒素的動物本身對其毒性有較強的耐受性[10-11]，這些動物食用有毒物質(zhì)后，不會出現(xiàn)中毒癥狀，反而會將吸收的毒素轉(zhuǎn)變?yōu)轶w內(nèi)的一部分蓄積起來，停止攝入有毒物質(zhì)后則毒性減少[12]。目前，在攜帶TTX的多種生物中，進行了廣泛的餌料飼喂研究，為TTX的食物來源提供了依據(jù)[13-15]。盡管TTX的最終來源仍不確定，但這些物種從食物中獲取TTX以及用它來增加自身的適應性是確定的。筆者開展高毒性半褶織紋螺的室內(nèi)飼養(yǎng)試驗，以投喂有毒餌料的方式，考察毒素在織紋螺體內(nèi)富集和消除的情況，進而探討半褶織紋螺體內(nèi)毒素的可能來源。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

半褶織紋螺采集自浙江溫嶺，另購買暗紋東方鲀的肝臟，冷凍保存，作為投喂織紋螺的有毒餌料;使用蝦肉作為無毒餌料。采用免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16]測得暗紋東方鲀的肝臟毒素含量約125 mg/kg，而蝦肉中未檢出毒素。

1.2?主要儀器與試劑

1.2.1?主要儀器。ACQUITYTM型超高效液相色譜儀、Waters Xevo TQS四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）;Centrifuge 5810高速離心機;VisiprepTMDL固相萃取裝置;MS2漩渦混合器; N-EVAP112氮吹儀;超聲波清洗器;河豚毒素（TTX）免疫親和柱。

1.2.2?試劑。

河豚毒素（TTX）標準品（純度≥98.0%）;乙酸、NaCl、Na2HPO4·12H2O、NaOH、NaH2PO4·2H2O、甲酸、乙酸銨、甲醇、乙腈;試驗用水均為超純水。

1.3?試驗設計

織紋螺清理干凈后，飼養(yǎng)在容積120 L的水箱內(nèi)，試驗用水為沉淀、過濾后的海水，鹽度為（24±2）‰，連續(xù)充氧，每2 d更換1次海水，室溫控制在（24±1） ℃，靜水條件凈化馴養(yǎng)7 d，期間不投食;7 d后每隔2 d投喂1次蝦肉，后續(xù)選擇狀態(tài)良好、大小均一的個體進行試驗。試驗期間織紋螺活動正常，健康無病，自然死亡率小于5%。

室內(nèi)模擬試驗設置處理組和對照組，每組又分為3個小組。處理組試驗分為暴露階段和凈化階段2個階段。暴露階段持續(xù)20 d，每天對織紋螺投喂有毒河豚魚肝臟。凈化階段持續(xù)50 d，每天投喂無毒蝦肉。整個試驗期間，對照組的織紋螺始終投喂無毒蝦肉。攝食2 h后換水。定期分別從處理組和對照組中各取樣約40個，于-20?℃下保存，備用。取樣時間點設置為0、1、3、6、10、16、20、21、23、25、28、30、40、50、60和70 d。

1.4?溶液配制

①TTX 標準溶液。準確稱取1.00 mg TTX 標準品，用含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（1∶1，V/V）溶液溶解并定容至50 mL，避光4 ℃冷藏保存，保存期限為6個月;使用時將濃度稀釋至1.0 μg/mL。②磷酸鹽緩沖液（PBS）。分別稱取NaCl 4.25 g，NaH2PO4·2H2O 1.09 g，Na2HPO4·12H2O 6.45 g，用超純水溶解并稀釋至500 mL。

1.5?樣品提取與凈化

1.5.1?樣品提取。

清洗并解剖織紋螺，將得到的所有軟體組織勻漿。準確稱取0.5～1.0 g已充分均質(zhì)的樣品置于50 mL離心管中，加入10 mL含有1%乙酸的甲醇溶液，渦旋振蕩3 min，60?℃水浴超聲提取15 min，冷卻至室溫后，6 000 r/min離心5 min。移取上清液1～2 mL，置于另一個10 mL離心管中，加入4倍體積的PBS 溶液稀釋，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為6.9～7.5，待過柱凈化。

1.5.2?免疫親和柱凈化。

免疫親和柱待溫度回至室溫，放出柱內(nèi)保存液，取樣品液過柱。過柱結(jié)束后用8 mL 20%甲醇水進行淋洗，淋洗完畢后擠干柱內(nèi)殘留液，并棄去以上全部流出液，最后用4 mL含2%乙酸的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，60 ℃水浴氮氣吹干，用1 mL含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液-乙腈（1∶9，V/V）溶解并定容，經(jīng)0.22 μm濾膜后供分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?TTX的UPLC-MS/MS分析方法?所用分析方法參照2015年實驗室已完善的海洋生物中TTX的測定方法[16]。將濃度1.0 μg/mL的TTX標準使用液逐級稀釋成濃度分別為2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100 ng/mL的標準工作液，繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=4 037.18x+31 207.5，相關系數(shù)R2=0.999 534，TTX在2.0～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好（圖2）。半褶織紋螺體內(nèi)TTX為主要毒素成分，色譜圖如圖3所示。由于缺少TTX同系物標準品，所以暫不討論其他同系物。

2.2?半褶織紋螺體內(nèi)毒素含量的變化?在整個試驗過程中，織紋螺攝食活躍，未觀察到異常情況。使用Sigmaplot軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行繪圖，如圖4所示。在暴露階段，投喂高毒性的河豚魚肝臟后，半褶織紋螺中的毒素含量迅速增加， 第20天升至最高（74.577 mg/kg）。當投喂無毒蝦肉后，毒素含量呈現(xiàn)下降趨勢，第25天短暫上升，此后繼續(xù)降低。第40天開始毒素含量又迅速上升，第60天含量上升至僅次于投毒階段結(jié)束時的含量。60 d后毒素含量降低但仍維持在較高水平。

在整個試驗過程中，對照組半褶織紋螺投喂無毒蝦肉，剛開始其毒素含量呈逐漸下降的趨勢，第16天毒素含量降至最低水平（0.14 mg/kg）。但此后至第25天毒素含量呈現(xiàn)升高趨勢，第25天毒素含量達到1.14 mg/kg，接近第0天水平，此后又呈現(xiàn)下降趨勢。第50～60天，毒素含量又迅速上升，第60天毒素含量大約是第0天時的4倍。試驗后期又降至較低水平。由此可見，處理組和對照組幾乎在同一時間段內(nèi)出現(xiàn)了毒素升高的情況。

3?討論

河豚毒素（tetrodotoxin，TTX）是一種小分子量非蛋白神經(jīng)毒素，劇毒，存在于織紋螺科的多種生物中。該研究發(fā)現(xiàn)，投喂高毒性餌料時處理組織紋螺并沒有中毒死亡，在行為上與對照組沒有任何區(qū)別，表明攜帶河豚毒素的生物對河豚毒素有較高的耐受性。在實驗室環(huán)境受控條件下，半褶織紋螺能夠通過食物鏈快速累積一定量的河豚毒素。當改投無毒餌料時，體內(nèi)累積的河豚毒素剛開始會呈現(xiàn)減少趨勢，但隨后幾乎在相同的時間段內(nèi)，處理組和對照組都出現(xiàn)了一個明顯的毒性高峰，因此很可能半褶織紋螺毒素由其自身產(chǎn)生。

張農(nóng)等[2]研究表明，織紋螺的毒性與其種類、生長季節(jié)、生活區(qū)域都有關系。通過監(jiān)測不同地區(qū)織紋螺毒性季節(jié)性消長，發(fā)現(xiàn)每年4—9月是毒力較高的時期，與已報道的食物中毒的變化規(guī)律[2，17-18]相一致。半褶織紋螺雖然大多數(shù)情況下無毒，但因季節(jié)和棲息地不同有時會有毒[1]。此次樣品均采自浙江溫嶺塢根鎮(zhèn)伏嶼山外海涂，排除了種內(nèi)地域性差異。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在相同的生態(tài)環(huán)境下，半褶織紋螺相比于其他螺類毒性更高，認為可能與其有較高的富集毒素能力有關[19]。此外在其他一些攜帶TTX的動物中發(fā)現(xiàn)，海星（Astropecten scoparius）毒性的季節(jié)變化規(guī)律與性成熟時期相關，9—11月為性成熟季節(jié)，毒性較高[20];河豚魚（T.niphobles）和（T.alboplumbeus）毒性的季節(jié)變化與他們的產(chǎn)卵季節(jié)有一定的相關性[21]。綜上所述，半褶織紋螺體內(nèi)高含量的河豚毒素可能通過食物鏈累積得到，同時在某些條件下其自身也會產(chǎn)生河豚毒素，并且體內(nèi)毒素的產(chǎn)生或累積遵循一定的生物節(jié)律，有可能與繁殖、產(chǎn)卵相關。

該研究表明織紋螺能夠通過食物鏈富集河豚毒素，但缺少對野外采樣環(huán)境中可識別的河豚毒素來源的調(diào)查，因此對織紋螺體內(nèi)河豚毒素食物鏈來源缺少有利的證據(jù)。后續(xù)將開展進一步的研究，選擇代表性地區(qū)進行長期采樣和毒性監(jiān)測，同時對采樣環(huán)境中其他生物等各種因子進行密切觀測和調(diào)查，更全面闡明織紋螺體內(nèi)毒素來源的問題。

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