蒸汽爆破預(yù)處理對(duì)樟芝液體培養(yǎng)的影響

沈宇健，張 蕾，景思佳，劉 洋，張 帆

（1.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院生物工程系，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310023；3.浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310023；4.杭州市園林科學(xué)研究院，浙江 杭州 310013）

樟芝Ganoderma camphoratum是臺(tái)灣地區(qū)特有珍貴食（藥）真菌。近年已證實(shí)的具有保肝、抗氧化、抗發(fā)炎、抗腫瘤、抗血小板凝集等作用[1-10]，其中主要生物活性成分有三萜類(lèi)化合物，多糖、腺苷等[11]。但樟芝的自然生長(zhǎng)條件苛刻，生長(zhǎng)極為緩慢，再加上野生牛樟樹(shù)Cinnamomum kanehirai老樹(shù)更是罕見(jiàn)，導(dǎo)致其自然資源嚴(yán)重短缺，價(jià)格一路飆升，因此人工培養(yǎng)樟芝是未來(lái)發(fā)展的方向，只是不同的培養(yǎng)方法都有缺陷[12]。目前認(rèn)為椴木培養(yǎng)法所獲得的樟芝子實(shí)體功效最佳，該方法用樟芝原特有宿主牛樟樹(shù)椴木為培養(yǎng)基，可獲得與野生子實(shí)體相同的生物活性成分，尤其是三萜類(lèi)化合物，但其存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1～ 3 a、培養(yǎng)成本較高，且發(fā)展樟芝的椴木培養(yǎng)法成為了牛樟樹(shù)被盜伐的主要原因，也讓原本就稀少的牛樟樹(shù)到了瀕臨絕種的地步[13-14]。雖然樟芝仍無(wú)法以椴木方式大量栽培子實(shí)體，但已可用固體及液體菌種培養(yǎng)方式進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)樟芝菌絲體。固體菌種培養(yǎng)法獲得的子實(shí)體具有與野生樟芝更為接近的生物活性，培養(yǎng)時(shí)間約3 個(gè)月[15]，但是此方法面臨不能去除木屑及其他不可食用部分、產(chǎn)量少，且周期長(zhǎng)，不太適宜工業(yè)化生產(chǎn)。液體培養(yǎng)具有生長(zhǎng)周期短、成本低、易于大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在生物活性含量較低的問(wèn)題，所以有關(guān)如何提高樟芝液體培養(yǎng)生物活性產(chǎn)物的研究報(bào)道就一直層現(xiàn)疊出。

本實(shí)驗(yàn)前期通過(guò)添加牛樟樹(shù)C.kanehirai，黃樟C.porrectum，華南桂C.austrosinense，樟C.camphora，山橿Lindera reflexa，香桂C.subavenium，銀木C.septentrionale，猴樟C.bodinieri，蘭嶼肉桂C.kotoense，浙江桂C.chekiangense，天竺桂C.japonicum，新木姜子Neolitsea aurata共12 種樟科Lauraceae 植物的提取物對(duì)樟芝液體培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明猴樟水提物對(duì)樟芝液體培養(yǎng)具有很好的促進(jìn)作用。但提取主要分布在樟科植物纖維內(nèi)側(cè)的活性成分，就必須克服表皮、纖維層，以及細(xì)胞壁的傳質(zhì)阻力，特別是結(jié)構(gòu)致密的細(xì)胞壁，是提取活性成分的主要障礙，現(xiàn)行的化學(xué)浸提等方法的效率不高且容易對(duì)人體有害[16]。因此迫切需要一種預(yù)處理方法，即可提高得率、縮短時(shí)間、且成本低對(duì)環(huán)境無(wú)害。經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、處理時(shí)間短且易于大規(guī)模生產(chǎn)的蒸汽爆破[17-20]（以下簡(jiǎn)稱(chēng)汽爆）預(yù)處理法是近年來(lái)逐漸發(fā)展起來(lái)的一種方法，使用一定壓力的水蒸氣、空氣等介質(zhì)對(duì)植物進(jìn)行爆破，此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于制漿工業(yè)、動(dòng)物飼料的生產(chǎn)，根據(jù)徐紅關(guān)于蒸汽爆破預(yù)處理紅柳Tamarix ramosissima的酶解發(fā)酵性能研究[18]，降低蒸汽壓力而延長(zhǎng)維壓時(shí)間對(duì)提取效果更好，因此汽爆技術(shù)在對(duì)樟科植物的預(yù)處理中具有一定的可行性。本實(shí)驗(yàn)在汽爆壓力為2.00 MPa 的條件下，選擇7 個(gè)維壓時(shí)間來(lái)分析汽爆對(duì)于猴樟樹(shù)枝水提物的影響，以期優(yōu)化樟芝液體培養(yǎng)的工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 樟芝，2012 年從臺(tái)灣自然科學(xué)博物館引進(jìn)，在浙江省農(nóng)產(chǎn)品化學(xué)與生物加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室采用超低溫保藏法-80℃低溫保藏。

1.1.2 植物材料 2016 年10 月和2017 年10 月分別在杭州植物園采集樹(shù)齡10 a 以上的猴樟樹(shù)枝，由于樟芝僅生長(zhǎng)在牛樟樹(shù)腐朽之心材內(nèi)壁或枯死倒地的牛樟木之陰暗潮濕面，故使用高枝剪剪取同一株樹(shù)的老枝，使用粉碎儀進(jìn)行粉碎至小碎片，粉碎后的總樹(shù)枝量在720.00 g 以上。

1.1.3 試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB）、樟腦油、95%乙醇、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、高氯酸、冰醋酸、香蘭素、香草醛、二氯甲烷、濃硫酸、蒽酮，均購(gòu)自浙江常青化工有限公司，其中試劑類(lèi)為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。

1.1.4 試劑配制 0.80 mol·L-1重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液：基準(zhǔn)重鉻酸鉀39.25 g·L-1；0.20 mol·L-1硫酸亞鐵溶液：硫酸亞鐵56.00 g·L-1，濃硫酸15.00 mL；鄰啡羅啉指示劑：鄰二氮菲11.46 g·L-1，硫酸亞鐵6.95 g·L-1；1.00%醋酸溶液：36.00%乙酸1.00 mL；72.00%硫酸溶液：98.00%硫酸652.00 mL；10.00%氯化鋇溶液：氯化鋇100.00 g·L-1；10.00%硫酸溶液：98.00%硫酸593.40 mL；20.00%碘化鉀溶液：碘化鉀200.00 g·L-1；1.00%淀粉溶液：淀粉10.00 g·L-1；0.20 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液：硫代硫酸鈉49.60 g·L-1，碳酸鈉0.50 g；0.10 mol·L-1硫代硫酸鈉溶液：硫代硫酸鈉24.80 g·L-1，碳酸鈉0.50 g；以上試劑配制的溶液均為去離子水。乙醇、乙醚混合液：乙醚 1.00 mL，乙醇 20.00 mL；醋酸、硝酸混合液：醋酸5.00 mL，硝酸5.00 mL。

1.1.5 培養(yǎng)基 菌種活化培養(yǎng)基：PDA 39.00 g·L-1，葡萄糖10.00 g·L-1，瓊脂10.00 g·L-1，pH 自然；液體一級(jí)培養(yǎng)基：PDB 24.00 g·L-1，葡萄糖10.00 g·L-1，pH 自然；液體二級(jí)培養(yǎng)基：PDB 24.00 g·L-1，葡萄糖10.00 g·L-1，pH 自然。

1.1.6 主要儀器 QBS-80 汽爆試驗(yàn)臺(tái)，鶴壁正道生物能源有限公司；紫外分光光度計(jì)UV-5500PC，上海元析儀器有限公司；EYELA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；真空冷凍干燥儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高效液相色譜儀，美國(guó)waters 公司；無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州佳寶凈化工程設(shè)計(jì)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 汽爆處理 將粉碎并放置于烘箱50℃烘干至恒質(zhì)量后的猴樟樹(shù)枝進(jìn)行汽爆，每次投料量為90.00 g 左右，加熱介質(zhì)為150～ 180℃飽和水蒸汽，汽爆壓力為2.00 MPa，按120，180，240，300，360，420，480 s 共7 個(gè)維壓時(shí)間分7 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，汽爆后，再放置于烘箱50℃烘干，干燥保存，對(duì)照組為同樣放置于烘箱50℃烘干至恒質(zhì)量但未汽爆的猴樟，共8 個(gè)組。

1.2.2 樹(shù)枝提取物制備 將8 個(gè)組的猴樟，各取16.00 g 分別加入400.00 mL 的去離子水中，100℃水浴1 h，過(guò)濾，再將濾渣加入400.00 mL 的去離子水，100℃水浴1 h，過(guò)濾后將2 次濾液合并，真空冷凍干燥后，保存在4℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 掃描電鏡 8 個(gè)組各取一小片烘干后的猴樟，用黑色導(dǎo)電膠固定于玻片上，放入儀器進(jìn)行掃描。

1.2.4 碳元素的測(cè)定 8 個(gè)組各取0.010 g 的樣品放入硬管，加5.00 mL 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液和5.00 mL 濃硫酸并轉(zhuǎn)移至試管。油浴加熱，油浴溫度為170～ 180℃，保持溶液沸騰5 min。取出并冷卻后進(jìn)行滴定，指示劑為鄰啡羅啉，滴定液為硫酸亞鐵溶液，滴定終點(diǎn)為溶液從橙黃變到棕紅色時(shí)。同時(shí)以加0.10～ 0.50 g 的石英砂作為空白對(duì)照進(jìn)行空白滴定，記錄硫酸亞鐵的用量（V0），并以重量法測(cè)定樣品水分，根據(jù)公式（1）計(jì)算出含碳量。每組樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

式中，0.800 0 為1/6 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；0.003 為1/4 碳原子的摩爾質(zhì)量，g·mol-1；1.1 為氧化校正系數(shù)；V0為空白滴定用去硫酸亞鐵溶液的體積，mL；V為滴定試樣用去硫酸亞鐵溶液的體積，mL；m為風(fēng)干試樣質(zhì)量，g；K為將風(fēng)干試樣換算成烘干試樣的水分換算系數(shù)。

1.2.5 氮元素的測(cè)定 8 個(gè)組各稱(chēng)取1.00～ 2.00 g 的樣品，放入裝有10.00 mL 硝酸、20.00 mL 濃硫酸的消化管，加入0.20 g 硫酸銅和6.00 g 硫酸鉀，進(jìn)行消化并升溫：140℃維持30 min，320℃維持10 min，420℃維持40 min。然后使用凱氏測(cè)氮儀測(cè)定含氮量[21]。每組樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.2.6 木質(zhì)素的測(cè)定 8 個(gè)組各稱(chēng)取 0.050 g 的樣品于離心管中，加入1%的醋酸溶液10.00 mL，離心15 min。加3.00～ 4.00 mL 乙醇、乙醚混合液，浸泡3 min，棄去上清液，浸洗3 次。沉淀于100℃水浴蒸干，加入72%硫酸3.00 mL，靜置16 h。加入10.00 mL 蒸餾水，100℃水浴5 min，冷卻。加入5.00 mL 蒸餾水和10%的氯化鋇溶液0.50 mL，離心15 min。沉淀用蒸餾水沖洗2 次，加入10%的硫酸10.00 mL 和0.025 mol·L-1的重鉻酸鉀溶液10.00 mL，100℃水浴15 min，并攪拌。冷卻并進(jìn)行滴定，指示劑為5.00 mL 20%的碘化鉀溶液，滴定液為0.20 mol·L-1硫代硫酸鈉，滴定終點(diǎn)為溶液變?yōu)樽丶t色時(shí)。滴定結(jié)束后，再加入1.00 mL 1%的淀粉溶液作為指示劑，滴定液仍為0.20 mol·L-1硫代硫酸鈉，滴定終點(diǎn)為溶液從藍(lán)色變?yōu)榱辆G色時(shí)。同時(shí)以未加樣品，加入10%的硫酸10.00 mL 和0.025 mol·L-1的重鉻酸鉀溶液10.00 mL 作為空白對(duì)照進(jìn)行空白滴定作為驗(yàn)證。根據(jù)公式（2）計(jì)算木質(zhì)素含量。每組樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

式中，K為硫代硫酸鈉的濃度，mol·L-1；a為空白滴定所消耗硫代硫酸鈉的體積，mL；b為溶液所消耗硫代硫酸鈉的體積，mL；N為所取鋸末的質(zhì)量，g；48 為1 mol C6H10O5相當(dāng)于硫代硫酸鈉（一定濃度）的滴定度。

1.2.7 纖維素的測(cè)定 8 個(gè)組各稱(chēng)取0.10 g 的樣品于試管中，加入5.00 mL 醋酸、硝酸混合液，100℃水浴30 min，轉(zhuǎn)移至離心管，加去離子水，冷卻并離心15 min，棄去上清液，離心3 次，烘干。取烘干樣加入0.50 mol·L-1的重鉻酸鉀溶液10.00 mL 和濃硫酸8.00 mL，搖勻，100℃水浴15 min，冷卻并進(jìn)行滴定，指示劑為20%的碘化鉀溶液5.00 mL，滴定液為0.10 mol·L-1硫代硫酸鈉，滴定終點(diǎn)為溶液變?yōu)樗{(lán)色，且半分鐘內(nèi)不褪色，再以未加樣品作為空白對(duì)照進(jìn)行空白滴定。根據(jù)公式（3）計(jì)算纖維素含量。每組樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

式中，K為硫代硫酸鈉濃度，mol·L-1；a為空白滴定所耗硫代硫酸鈉體積，mL；b為溶液滴定所耗硫代硫酸鈉體積，mL；N為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.8 菌株培養(yǎng)

1.2.8.1 活化菌株 對(duì)低溫保存的菌株采用菌種活化培養(yǎng)基的方式進(jìn)行活化。把配制好的菌種活化培養(yǎng)基放入滅菌鍋內(nèi)，在121℃，0.10 MPa 的條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基并冷卻至室溫，在無(wú)菌條件下，將菌株接入培養(yǎng)基，置于人工智能氣候箱，28℃避光培養(yǎng)15 d，于-4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8.2 液體一級(jí)培養(yǎng) 分別將配制好的100.00 mL 液體一級(jí)培養(yǎng)基放入250.00 mL 的錐形瓶中，分別添加8 個(gè)組的猴樟水提物各40.00 mg，在121℃，0.1 MPa 的條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基并冷卻至室溫；在無(wú)菌條件下接入活化好的菌種，轉(zhuǎn)接量為每瓶2 粒（2×1 cm2），并封口。置于搖床（120 r·min-1，28℃）震蕩培養(yǎng)4d，促進(jìn)菌絲體的生長(zhǎng)。每組樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.2.8.3 液體二級(jí)培養(yǎng) 分別將配制好的100.00 mL 液體二級(jí)培養(yǎng)基放入250.00 mL 的錐形瓶中，并在二級(jí)培養(yǎng)基中分別添加8 個(gè)組的猴樟水提物各40.00 mg，在121℃，0.10 MPa 的條件下滅菌20 min，取出培養(yǎng)基并冷卻至室溫；在無(wú)菌條件下接入培養(yǎng)4 天后的一級(jí)培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)接量為二級(jí)培養(yǎng)基的10%，置于搖床（120 r·min-1，28℃）震蕩培養(yǎng)4 d，進(jìn)行菌絲體的擴(kuò)大培養(yǎng)。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.2.9 生物量的測(cè)定 取二級(jí)液體培養(yǎng)基中的發(fā)酵液，用3 層200 目的尼龍網(wǎng)過(guò)濾，得到菌絲體，用蒸餾水沖洗菌絲體3 次后，置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥后，研磨成粉，分別測(cè)定樟芝菌絲體粉末的干重，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.10 總?cè)坪繙y(cè)定 取實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基與對(duì)照組培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并過(guò)濾冷凍干燥后的樟芝菌絲體，研磨成粉，測(cè)定總?cè)频暮?。參照陸震鳴等[22]的方法，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用香草醛-冰乙酸顯色法測(cè)定。測(cè)定前，采用紫外分光光度計(jì)于400～ 700 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在550 nm 處具有最大吸光值，所以該反應(yīng)的吸收波長(zhǎng)設(shè)定為550 nm。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精確稱(chēng)取齊墩果酸10.00 mg，置于50.00 mL 容量瓶，加二氯甲烷定容至刻度，配制成濃度為0.20 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精確量取濃度為0.20 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.00，0.10，0.20，0.50，1.00，1.50 mL，分別放入具塞磨口試管中，加熱去除溶劑，然后各加入0.30 mL 的5%香草醛—冰醋酸溶液和1.00 mL 高氯酸，加塞。于60℃恒溫水浴20 min，取出后立即用冰水冷卻，再分別加入5.00 mL 冰醋酸，在漩渦混合器混合均勻，在550 nm 處測(cè)定吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，齊墩果酸濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

樣品溶液及總?cè)茰y(cè)定：取樟芝菌絲體粉末0.10 g 于10.00 mL 的蒸餾水中，于100℃水浴回流2 h，冷卻后以1:4 的比例加入無(wú)水乙醇，置于4℃沉淀過(guò)夜，抽濾，取其濾液各1.00 mL，置于3 個(gè)磨口試管中，加熱蒸干溶劑，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算不同培養(yǎng)基樟芝菌絲體中總?cè)坪?。根?jù)下式計(jì)算總?cè)频寐剩?/p>

式中，X為樣品中總?cè)祁?lèi)含量，g·100g-1；M1為樣品的質(zhì)量，g；M2為通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)算得的測(cè)定用樣液三萜類(lèi)含量，mg；V1為待測(cè)液定容的體積，mL；V2為待測(cè)用的樣液體積，mL。

1.2.11 多糖含量測(cè)定 取實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基與對(duì)照組培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并過(guò)濾冷凍干燥后的樟芝菌絲體，研磨成粉，測(cè)定多糖含量。參照《中國(guó)藥典》的多糖測(cè)定方法[23]，以無(wú)水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚—硫酸法測(cè)定。測(cè)定前，采用紫外分光光度計(jì)于400～ 800 nm 波長(zhǎng)處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示在620 nm 處具有最大吸光值，所以該反應(yīng)的吸收波長(zhǎng)設(shè)定為620 nm 。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精確稱(chēng)取105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg 定容于1 000.00 mL，配制成濃度為0.10 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：精確吸取0.10%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60 mL，分別放入具塞磨口試管中，分別加水至1.00 mL，各加5.00 mL 蒽酮試劑，震蕩混勻，水浴20 min，取出冷卻至室溫，在620 nm 處測(cè)定吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

樣品溶液及胞內(nèi)多糖測(cè)定：取樟芝菌絲體粉末0.20 g 于20.00 mL 的蒸餾水中，80℃水浴加熱2 h，冷卻，然后加入1:4 體積的無(wú)水乙醇混勻，置于4℃沉淀過(guò)夜，離心分離沉淀、過(guò)濾，除去濾渣，得樟芝粗多糖樣品溶液，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算多糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，DPS 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05 為差異顯著，以P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同維壓時(shí)間猴樟組織結(jié)構(gòu)的研究

汽爆預(yù)處理可以有效的改變猴樟木質(zhì)纖維的天然結(jié)構(gòu)，隨著汽爆時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)的激烈程度不斷增加，導(dǎo)致猴樟的顏色由原來(lái)的褐色逐漸過(guò)渡到黑色，外形也由原來(lái)的塊狀過(guò)渡到纖維狀。根據(jù)文獻(xiàn)記載[24]，纖維素完全降解的溫度約360℃，木質(zhì)素的降解溫度在280～500℃。雖然本實(shí)驗(yàn)汽爆過(guò)程的蒸汽溫度在 150～ 180℃之間，并沒(méi)有到讓纖維素和木質(zhì)素可以完全降解的程度，但不同的維壓時(shí)間也會(huì)讓纖維素、木質(zhì)素發(fā)生不同程度的降解。

圖1 為不同汽爆時(shí)間猴樟組織結(jié)構(gòu)在掃描電鏡下的圖片（×1 000 倍）。從圖1 中可以看出不同汽爆時(shí)間預(yù)處理過(guò)的猴樟有明顯的不同。圖1（A）為未汽爆過(guò)的樣品，標(biāo)明粗糙，纖維束結(jié)合緊密；圖1（B）為汽爆120 s，組織變得松散，纖維表面開(kāi)始出現(xiàn)裂紋；圖1（C）為汽爆180 s 后，組織的空腔開(kāi)始增大，纖維表面出現(xiàn)更多的裂紋和裂片；圖1（D）為汽爆240 s 后，纖維束間發(fā)生分離，表面的孔增多；圖1（E）汽爆300 s 后，可以明顯看到纖維的斷裂；圖1（F）汽爆360 s 后、（G）為汽爆420 s 后，樣品表面出現(xiàn)微孔；圖1（H）汽爆480 s 后，結(jié)合在纖維束周?chē)募?xì)小纖維消失，表面出現(xiàn)更多微孔。文獻(xiàn)顯示對(duì)植物的提取過(guò)程中傳質(zhì)過(guò)程是關(guān)鍵的限速步驟。汽爆預(yù)處理后，猴樟樹(shù)枝破碎成更小的碎塊，且表面造成很多微孔，可以增加提取效率[20]。

圖1 不同汽爆時(shí)間猴樟的掃描電鏡圖Figure 1 Pictures by scanning electron microscope of C.bodinieri after different duration of steam explosion

2.2 不同維壓時(shí)間對(duì)猴樟纖維素、木質(zhì)素含量的影響

一般植物纖維素占40%～ 50%，木質(zhì)素占20%～ 30%，均是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的主要成分。纖維素是一種不溶于水及一般有機(jī)溶劑的大分子多糖，被木質(zhì)素包裹，占植物界碳含量的50%以上；木質(zhì)素是包圍于管胞、導(dǎo)管及木纖維素等纖維束細(xì)胞及厚壁細(xì)胞外的物質(zhì)，具有某些側(cè)鏈的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，很難分解。因此，纖維素、木質(zhì)素阻礙了植物的提取。汽爆是依靠一定壓力的飽和蒸汽對(duì)汽爆缸里的物料進(jìn)行加熱和滲透，再突然將物料置于一定的大氣壓力下，從而完成纖維素和木質(zhì)素有選擇性的分離，所以汽爆的維壓時(shí)間對(duì)其處理的效果起到?jīng)Q定性的作用。圖2 是蒸汽壓力在2.00 MPa 時(shí)，不同的維壓時(shí)間對(duì)纖維素和木質(zhì)素的影響，從圖2 可見(jiàn)由于維壓時(shí)間越長(zhǎng)汽爆的強(qiáng)度就越大，對(duì)猴樟的纖維素和木質(zhì)素的破壞力就越大。

纖維素在120 s 的時(shí)候與未汽爆呈現(xiàn)的是下降的趨勢(shì)，這可能是一下汽爆之后，壓力和溫度的同時(shí)作用，造成纖維性的降解，在120～180 s 的時(shí)候纖維素含量開(kāi)始增加，維壓時(shí)間在240 s 時(shí)，纖維素含量基本維持不變，在300～480 s 時(shí)間段內(nèi)，纖維素含量持續(xù)呈上升趨勢(shì)，最高在480 s 時(shí)達(dá)到58.20 %。而隨著維壓時(shí)間的增加，猴樟中的木質(zhì)素含量持續(xù)呈上升趨勢(shì)。造成這一現(xiàn)象的原因估計(jì)是猴樟本身的特殊性，猴樟是慢生樹(shù)種，質(zhì)地堅(jiān)實(shí)、紋理細(xì)密，木質(zhì)素含量較高，且木質(zhì)素的降解溫度在280～ 500℃，短時(shí)間的維壓時(shí)間，不能有效的破壞木質(zhì)素。對(duì)猴樟進(jìn)行汽爆預(yù)處理有效提高了纖維素的有效含量，同時(shí)也有效破壞了猴樟的木質(zhì)天然結(jié)構(gòu)，增加了猴樟作為提取物料的比表面積，以利于后續(xù)的提取。

圖2 不同維壓時(shí)間對(duì)猴樟纖維素和木質(zhì)素的影響Figure 2 Effect of different duration of steam explosion on cellulose and lignin of C.bodinieri

2.3 不同維壓時(shí)間對(duì)猴樟碳、氮含量的影響

表1 是在不同維壓時(shí)間內(nèi)碳、氮含量以及碳氮比。從表1 中可以看出隨著維壓時(shí)間的增加，碳、氮含量總體趨勢(shì)是呈上升的，這也和圖2 中纖維素和木質(zhì)素含量的情況一致，汽爆預(yù)處理破壞了細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，且維壓時(shí)間越長(zhǎng)破壞的程度就越大，更減少木質(zhì)素對(duì)纖維素的包裹作用。

碳源、氮源在生物的生長(zhǎng)過(guò)程中起著非常重要的作用，研究表明，過(guò)高或過(guò)低的碳氮比均不利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，濃度過(guò)高，不利于產(chǎn)物的積累。在未汽爆前，猴樟樹(shù)枝的碳氮比為89，汽爆后由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的破壞，引起細(xì)胞內(nèi)含物的溢出，氮含量隨之上升，使得碳氮比持續(xù)下降，在300 s 時(shí)下降到真菌培養(yǎng)基的理想水平25，而到480 s 時(shí)已降到16，因此，后續(xù)可用汽爆預(yù)處理后的猴樟樹(shù)枝作為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)樟芝。

表1 不同維壓時(shí)間對(duì)猴樟碳、氮含量以及碳氮比的影響Table 1 Effect of different duration of steam explosion on carbon,nitrogen content and carbon-nitrogen ratio of C.bodinieri

2.4 不同維壓時(shí)間的猴樟水提物對(duì)樟芝液體培養(yǎng)總?cè)?、總多糖含量的影?/h3>

從圖3 中可見(jiàn)，與對(duì)照猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體相比，在液體培養(yǎng)基中添加汽爆預(yù)處理的猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體，均呈現(xiàn)出不同程度促進(jìn)總?cè)坪康淖饔?，其中維壓時(shí)間在120～ 300 s，菌絲體總?cè)坪砍掷m(xù)上升，并在300 s 達(dá)到最高值2.90%，比對(duì)照組提高了16.80%，而維壓時(shí)間在360～ 480 s，總?cè)坪砍掷m(xù)下降，到480 s 時(shí)比300 s 的總?cè)坪肯陆盗?.50%，但仍比對(duì)照組提高了13.90%。從圖4 可見(jiàn)，與對(duì)照猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體相比，在液體培養(yǎng)基中添加汽爆預(yù)處理的猴樟水提物培養(yǎng)的菌絲體，總多糖含量持續(xù)上升。480 s 維壓時(shí)間時(shí)總多糖含量到最高值2.80%，比對(duì)照組提高25.00%。由此可見(jiàn)，汽爆預(yù)處理對(duì)猴樟的木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的破壞，有效提高了猴樟的水提效果，間接促進(jìn)了樟芝液體培養(yǎng)菌絲體的總?cè)?、總多糖的含量。雖然目前測(cè)定的總?cè)?、總多糖是液體培養(yǎng)樟芝菌絲體的粗提物，但也可以間接反映出汽爆后的猴樟水提物有效促進(jìn)了樟芝液體培養(yǎng)時(shí)分泌一些活性成分。

圖3 不同維壓時(shí)間的猴樟水提物對(duì)樟芝液體培養(yǎng)菌絲體總?cè)坪康挠绊慒igure 3 Effect of water extract from C.bodinieri treated by different explosion duration on total triterpene content of mycelium in liquid culture of G.camphoratum

圖4 不同維壓時(shí)間的猴樟水提物對(duì)樟芝液體培養(yǎng)菌絲體總多糖含量的影響Figure 4 Effects of water extract from C.bodinieri treated by different explosion duration on total polysaccharide content of mycelium in liquid culture of G.camphoratum

3 結(jié)論與討論

高效、清潔預(yù)處理是給培養(yǎng)基添加促進(jìn)因子的首要步驟，現(xiàn)在常用的化學(xué)法存在化學(xué)品消耗、環(huán)境污染和有毒害等的壓力，與其相比，汽爆具有處理時(shí)間短、污染少和無(wú)毒害等的優(yōu)點(diǎn)，具有研究和發(fā)展的前景。

汽爆前后猴樟的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，顏色也明顯變深，推測(cè)是由于纖維降解產(chǎn)生的糖類(lèi)與猴樟樹(shù)枝中的某些物質(zhì)產(chǎn)生美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)。隨著維壓時(shí)間的增加，汽爆后猴樟樹(shù)枝的細(xì)小碎塊量明顯增加，掃描電鏡圖中可以看出大的碎塊斷裂成小的纖維束，這是由于一些物理化學(xué)變化加速了纖維等的降解。且汽爆預(yù)處理的強(qiáng)大機(jī)械力一定程度上破壞了猴樟的細(xì)胞壁，更加便于之后的浸潤(rùn)，提取。

從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果中可以看出汽爆預(yù)處理是一種有效方法，經(jīng)過(guò)蒸汽爆破處理后各組分含量顯著變化，破壞猴樟的木質(zhì)天然結(jié)構(gòu)，提高纖維素、木質(zhì)素、碳和氮含量，降低碳氮比，且添加汽爆預(yù)處理之后的猴樟水提物到樟芝液體培養(yǎng)基中，7 個(gè)組均可以有效提高菌絲體的總?cè)坪涂偠嗵呛?，最高值比?duì)照組分別提高了16.80%和25.00%。當(dāng)維壓時(shí)間在300 s 時(shí)，總?cè)频暮孔畲?，隨著維壓時(shí)間的增加而略微有點(diǎn)下降，排除實(shí)驗(yàn)誤差的可能性，本實(shí)驗(yàn)采用2.00 MPa 的蒸汽壓力對(duì)應(yīng)的蒸汽溫度為150～ 180℃，而纖維素、木質(zhì)素的完全降解溫度都在280℃之上，推測(cè)蒸汽壓力不夠?qū)е聦?duì)纖維素和木質(zhì)素的破壞不夠，這就證實(shí)了維壓時(shí)間只是破壞猴樟細(xì)胞壁提高活性物質(zhì)提取率的主要因素之一。近年來(lái)的研究表明降低蒸汽壓力而延長(zhǎng)維壓時(shí)間的提取效果更好，故本實(shí)驗(yàn)僅采用單因素即只考慮汽爆不同的維壓時(shí)間對(duì)猴樟樹(shù)枝水提物的影響，造成這個(gè)現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橹捌瑧?yīng)用在秸稈等木質(zhì)素含量低的植物為主，對(duì)木質(zhì)素含量較高的植物來(lái)說(shuō)，質(zhì)地更為堅(jiān)硬，延長(zhǎng)維壓時(shí)間不能有效的軟化物料，效果不如提高蒸汽壓力，今后需要將二者整合為強(qiáng)度系數(shù)來(lái)作為汽爆預(yù)處理的綜合指標(biāo)，便于后續(xù)最佳的工藝參數(shù)確定。