基于ISSR分子標(biāo)記對(duì)黑河流域中下游黑果枸杞16個(gè)居群的遺傳多樣性分析

林麗 張敏 杜爭(zhēng) 朱田田

摘要：目的 ?研究黑河流域中下游黑果枸杞16個(gè)野生居群的遺傳多樣性，為黑果枸杞的遺傳育種及保護(hù)機(jī)制研究提供依據(jù)。方法 ?在建立ISSR分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，人工讀帶確定引物位點(diǎn)，利用Popgen32軟件分析黑果枸杞的多態(tài)性、遺傳相似系數(shù)及遺傳距離。使用NTSYS軟件建立黑果枸杞的遺傳距離聚類圖。結(jié)果 ?采用6個(gè)ISSR引物對(duì)16個(gè)黑果枸杞居群的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增后共檢測(cè)到126個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率為92.86%，不同居群間的多態(tài)位點(diǎn)百分率范圍為6.35%～50.00%。Neis基因多樣性指數(shù)H為0.222 8，Shannon信息指數(shù)I為0.345 9，分析得出居群間的變異為41.85%。聚類的遺傳距離介于0.03～0.16，大體聚為2類。結(jié)論 ?黑河流域中下游黑果枸杞在種群水平上遺傳多樣性豐富，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力較強(qiáng);黑果枸杞有復(fù)雜的遺傳背景，且與地理來(lái)源相關(guān)性不強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：黑果枸杞;ISSR分子標(biāo)記;遺傳多樣性

中圖分類號(hào)：R282.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）11-0062-06

Abstract： Objective To study the genetic diversity of 16 wild populations of Lycium ruthenicum Murr.; To provide a theoretical basis for genetic breeding and establishment of protective mechanisms of Lycium ruthenicum Murr.. Methods Based on the establishment of ISSR molecular markers， the artificial reading bands were used to identify the primer sites. The polymorphisms， genetic similarity coefficients and genetic distances of Lycium ruthenicum Murr. were analyzed using Popgen32 software. NTSYS software was used to establish a genetic distance clustering map of Lycium ruthenicum Murr.. Results Totally 6 ISSR primers were used to amplify the genomic DNA of 16 populations and a total of 126 sites were detected. The percentage of polymorphic sites was 92.86%. The percentage of polymorphic sites among different populations was in the range of 6.35%–50.00%. The Neis gene diversity index H was 0.222 8 and Shannons information index I was 0.345 9. The analysis showed that the variation among populations was 41.85%. The genetic distance of clustering was in the range of 0.03–0.16， which could roughly be divided into two categories. Conclusion The genetic diversity of Lycium ruthenicum Murr. in middle and lower reaches of Heihe River basin is abundant at the population level， and has a strong adaptability to the environment. Lycium ruthenicum Murr. has a complex genetic background and is not strongly related to geographical origin.

Keywords： Lycium ruthenicum Murr.; ISSR molecular markers; genetic diversity

黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.為茄科枸杞屬植物，主要分布于寧夏、甘肅、青海、新疆、內(nèi)蒙古等地[1]。黑果枸杞藥用部位為果實(shí)，味甘、性平，用于治療腰膝酸軟、心臟病等。藥理研究表明，黑果枸杞具有增強(qiáng)免疫力、抗焦慮、預(yù)防癌癥、延緩衰老作用[2-5]。黑果枸杞不僅可藥食兩用，且抗鹽、耐旱及根系發(fā)達(dá)等特征使其適宜在干旱、半干旱地區(qū)種植，改善生態(tài)環(huán)境，因此，黑果枸杞藥用價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值兼具[6-8]。目前黑果枸杞野生資源大于栽培資源，但產(chǎn)量低且采摘困難，市場(chǎng)供不應(yīng)求，野生居群分布地區(qū)逐漸減少，資源開(kāi)發(fā)與利用均十分困難。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是基于DNA技術(shù)的分子標(biāo)記體系，可反映生物個(gè)體或種群之間的差異性DNA片段，相對(duì)于傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記，具有穩(wěn)定、精確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。基于SSR技術(shù)的ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是其中應(yīng)用最為廣泛的一種，以其方便、快捷、成本較低的優(yōu)勢(shì)，目前已廣泛應(yīng)用于各種植物的遺傳多樣性研究[9-14]。本研究根據(jù)黑果枸杞不同地理分布區(qū)，以16個(gè)種群黑果枸杞為材料，應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，依據(jù)群體遺傳學(xué)原理，進(jìn)行黑果枸杞遺傳多樣性研究，分析黑果枸杞居群的遺傳規(guī)律，探明其瀕危遺傳機(jī)制，為其種質(zhì)資源鑒定、遺傳保護(hù)及栽培繁育等提供依據(jù)。

1 ?儀器與試藥

PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra;TGL16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司;Gel Doc XRTM紫外光凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad;DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀、Biophotometer Plus蛋白核酸定量測(cè)定儀，德國(guó)Eppendorf公司。

無(wú)病蟲(chóng)害的黑果枸杞新鮮幼嫩葉片，放入硅膠中干燥保存[15]，樣品由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)晉玲教授鑒定為黑果枸杞Lycium ruthenicum Murr.，樣品采集信息見(jiàn)表1。植物DNA提取試劑盒，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;試驗(yàn)所用引物均由上海生物工程有限公司合成;PCR擴(kuò)增所用試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs、10×Buffer及提取DNA所用RNA酶，天根生化科技有限公司;Agarose瓊脂糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、Tris堿、石英砂、β-巰基乙醇、gold view核酸染料、EDTA、Marker，西安科昊生物工程有限責(zé)任公司。

2 ?方法

2.1 ?DNA提取與檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[15-16]方法適當(dāng)改良，提取黑果枸杞葉片DNA，配制瓊脂糖凝膠，濃度為0.8%，電泳成像后觀察提取的DNA是否清晰明亮、有無(wú)雜帶、擴(kuò)散條帶是否完整等。將提取的DNA裝入1.5 mL管中，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ?PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序

參照加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）提供的ISSR引物序列，對(duì)16個(gè)居群黑果枸杞葉片DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，最終選出擴(kuò)增條帶多、背景清晰的6條引物用于PCR擴(kuò)增及后續(xù)處理，引物信息見(jiàn)表2。

根據(jù)正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)體系對(duì)黑果枸杞16個(gè)居群共319個(gè)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系共20 μL，其中DNA 1 μL、引物1 μL、10×PCR Bufffer 2.5 μL、Mg2+ 1.5 μL、dNTP 0.7 μL、Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，用dH2O補(bǔ)足，共補(bǔ)13.1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，退火1.5 min，72 ℃延伸1.5 min，共40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。置于4 ℃冰箱保存。

2.3 ?電泳檢測(cè)

配制1.2%瓊脂糖凝膠，置于盛有5×TBE緩沖液的電泳槽，120 V穩(wěn)壓電泳1.5 h，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察，拍照保存。

2.4 ?遺傳多樣性分析

采用Image Lab 3.0軟件對(duì)所得圖譜進(jìn)行分析，每個(gè)條帶代表1個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)。電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性，將有帶和缺失分別賦予1和0，建立“0/1”矩陣，利用Popgen32軟件對(duì)319個(gè)黑果枸杞樣本擴(kuò)增條帶形成的“0/1”矩陣分析多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）[17]、等位基因平均數(shù)Na、Neis基因多樣性指數(shù)H、Shannon信息多樣性指數(shù)I、有效等位基因Ne、Neis遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。應(yīng)用NTSYS軟件建立黑果枸杞的UPGMA聚類樹(shù)狀圖[18-19]，分析16個(gè)黑果枸杞野生居群間的親緣關(guān)系。

3 ?結(jié)果與分析

3.1 ?PCR擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)16個(gè)居群的319個(gè)黑果枸杞樣品DNA擴(kuò)增，得到的條帶整體明亮且完整清晰，見(jiàn)圖1～圖4。

3.2 ?居群遺傳多樣性分析

采用6個(gè)ISSR引物對(duì)16個(gè)黑果枸杞居群的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共檢測(cè)到126個(gè)位點(diǎn)。6個(gè)引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為15～30條，條帶擴(kuò)增最多的是引物UBC-881（30條），最少的是引物UBC-876（15條），平均每個(gè)引物的大小介于200～1900 bp;其中117條具有多態(tài)性，計(jì)算得到多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為92.86%。16個(gè)黑果枸杞種質(zhì)材料的等位基因平均數(shù)Na、有效等位基因Ne、Neis基因多樣性指數(shù)H和Shannon信息指數(shù)I分別為1.928 6、1.376 4、0.222 8和0.345 9，標(biāo)準(zhǔn)差分別為0.258 6、0.377 4、0.188 7和0.252 9。不同居群內(nèi)的PPB介于6.35%～50.00%，Neis基因多樣性指數(shù)范圍為0.021 2～0.182 3，Shannon信息指數(shù)范圍為0.032 1～0.262 8，見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，16個(gè)居群的黑果枸杞具有較高的多態(tài)性，變異潛能大，進(jìn)一步說(shuō)明其具有復(fù)雜的遺傳背景。此外，由于各居群的PPB、Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)明顯低于種群間的多態(tài)位點(diǎn)百分率，說(shuō)明黑果枸杞居群內(nèi)的遺傳多樣性水平低于居群間。

3.3 ?居群間遺傳分化分析

通過(guò)Popgen32軟件分析得到319份黑果枸杞樣本居群間的遺傳多樣性Ht為0.222 6，居群內(nèi)遺傳多樣性Hs為0.129 4，根據(jù)Ht和Hs計(jì)算居群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.418 5。分析得出居群間的變異為41.85%，而居群內(nèi)的變異為58.15%，即居群內(nèi)的變異占總變異比例較大。當(dāng)基因流Nm>1時(shí)，居群間的基因值越大則基因交流越強(qiáng)[20]。本研究采用Popgen32軟件處理得到的Nm值為0.694 8，表明所研究的黑果枸杞居群間基因交流可能為0。

3.4 ?遺傳距離和遺傳相似性

利用Popgen32軟件對(duì)319個(gè)黑果枸杞DNA條帶組成的“0/1”矩陣進(jìn)行遺傳距離和遺傳相似性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。16個(gè)黑果枸杞居群的遺傳距離為0.033～0.255 3，平均0.121 8，遺傳距離最大的3號(hào)居群和16號(hào)居群為0.255 3，遺傳距離最小的1號(hào)居群和2號(hào)居群為0.033 0，說(shuō)明不同黑果枸杞居群之間存在較高的遺傳多樣性。16個(gè)群的遺傳相似系數(shù)介于0.774 7～0.967 5。遺傳相似系數(shù)最小的3號(hào)居群和16號(hào)居群為0.774 7，說(shuō)明這2個(gè)居群親緣關(guān)較遠(yuǎn);遺傳相似系數(shù)最大的1號(hào)居群和2號(hào)居群為0.967 5，說(shuō)明這2個(gè)居群親緣關(guān)最近。

3.5 ?聚類分析

應(yīng)用NTSYS軟件建立黑果枸杞16個(gè)居群的Neis遺傳距離UPGMA聚類圖（見(jiàn)圖5）。聚類的遺傳距離為0.03～0.16。在遺傳距離為0.16時(shí)，16個(gè)居群中的1、2、6、7、8、9、10、11、12、13、14號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅰ類，15、16號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅱ類。在遺傳距離為0.125附近，1、2、4、5號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅲ類，6、7、8、9、10、11、12、13、14號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅳ類。在遺傳距離為0.12附近，5、6號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅴ類，8、9、10、11、12、13和14號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅵ類。在遺傳距離為0.10時(shí)，7、8、9、10、14號(hào)的黑果枸杞野生居群聚為第Ⅶ類，12、13號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅷ類。在遺傳距離為0.085時(shí)，5、6號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅷ類，7號(hào)的黑果枸杞野生居群聚為第Ⅸ類。在遺傳距離為0.075時(shí)，1、2號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅸ類。3、4、5號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅹ類。在遺傳距離為0.07時(shí)，12、13號(hào)的黑果枸杞居群聚為第Ⅺ類。

4 ?討論

遺傳多樣性能夠反映一個(gè)物種的起源與進(jìn)化、繁殖活力和環(huán)境變化適應(yīng)力，在很大意義上決定了物種的數(shù)量、地理分布及未來(lái)的生存和發(fā)展，還可指導(dǎo)遺傳資源基因保護(hù)、鑒定和栽培繁育種質(zhì)資源，遺傳多樣性是人類賴以生存的基礎(chǔ)。由于黑果枸杞的分布生境大多比較脆弱，加之藥用部位為漿果，采摘困難，產(chǎn)量不高，而目前市場(chǎng)供不應(yīng)求，野生分布逐漸減少，生態(tài)環(huán)境也逐漸惡化。現(xiàn)階段對(duì)黑果枸杞的遺傳多樣性研究報(bào)道較少，且局限于新疆產(chǎn)的黑果枸杞[21]，而對(duì)其他主產(chǎn)區(qū)黑果枸杞未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)15個(gè)甘肅黑果枸杞居群和1個(gè)內(nèi)蒙額濟(jì)納旗黑果枸杞居群的遺傳多樣性進(jìn)行研究，通過(guò)小數(shù)量的遺傳資源，盡可能反映整個(gè)黑果枸杞野生群體的多樣性。本研究對(duì)篩選優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的優(yōu)良品種，指導(dǎo)黑果枸杞產(chǎn)業(yè)發(fā)展，建設(shè)引種栽培和種植基地，合理規(guī)劃開(kāi)采野生資源，保證資源的持續(xù)利用等有很大的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究運(yùn)用分子標(biāo)記的方法對(duì)選定黑果枸杞群體進(jìn)行擴(kuò)增，用Popgen32軟件分析黑果枸杞16個(gè)野生居群，共檢測(cè)到126個(gè)位點(diǎn)，其中117條具有多態(tài)性，PPB為92.86%，而各居群的PPB均低于該值，說(shuō)明有些位點(diǎn)分布不均勻，只在少數(shù)種群中能檢驗(yàn)出多態(tài)性。另外，高臺(tái)縣南華鎮(zhèn)墩仁村的黑果枸杞PPB僅為6.35%，可能有2個(gè)原因：一是采樣地點(diǎn)比較孤立，地理位置的局限性導(dǎo)致其遺傳多樣性較低;二是試驗(yàn)處理中的誤差可能導(dǎo)致該值偏小。16個(gè)黑果枸杞種質(zhì)材料的等位基因平均數(shù)為1.928 6，有效等位基因?yàn)?.376 4，Neis基因多樣性指數(shù)為0.222 8，Shannon信息指數(shù)為0.345 9，而后兩者變化趨勢(shì)大體一致。16個(gè)居群的黑果枸杞多態(tài)性高，變異潛能大，進(jìn)一步說(shuō)明其有復(fù)雜的遺傳背景。此外，由于各種群的PPB、Neis基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)明顯低于種群間的多態(tài)位點(diǎn)比率，說(shuō)明黑果枸杞居群內(nèi)的遺傳多樣性水平低于居群間。16個(gè)黑果枸杞居群的遺傳距離介于0.033 0～0.255 3，說(shuō)明不同黑果枸杞居群之間遺傳多樣性水平較高。遺傳相似系數(shù)介于0.774 7～0.967 5?？梢钥闯觯z傳距離與遺傳相似系數(shù)成反比，遺傳相似系數(shù)和遺傳距離反映遺傳分化程度，進(jìn)而反映其物種存在的久遠(yuǎn)性。聚類的遺傳距離為0.03～0.16，總共被聚為11類，其中甘州區(qū)海潮壩、甘州區(qū)靖安鄉(xiāng)上堡村四社的黑果枸杞居群遺傳距離最近，在0.03處就被聚為一類，說(shuō)明這2個(gè)居群的親緣關(guān)系近。從整體上看，各居群在遺傳距離與地理距離的關(guān)系上并沒(méi)有很強(qiáng)的相關(guān)性。

一般而言，所選取的樣本越大，涉及的地理范圍越廣，試驗(yàn)結(jié)果的可靠性就越大。本研究選取的樣本數(shù)較多，基本涵蓋了黑果枸杞在甘肅境內(nèi)的自然分布區(qū)域，結(jié)果較為可靠。

參考文獻(xiàn)：

[1] 匡可任，路安民.中國(guó)植物志[M].北京：科學(xué)出版社，1978：10.

[2] WANG H Q， LI J N， TAO W W， et al. Lycium ruthenicum studies：Molecular biology， phytochemistry and pharmacology[J]. Food Chemistry，2018，240：759-766.

[3] 孫慧娟，董玲，王嘉馨，等.黑果枸杞對(duì)H2O2誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，41（4）：301- 305.

[4] 馬曉杰，陳軼，劉潔，等.黑果枸杞對(duì)大鼠抗焦慮作用的研究及對(duì)海馬內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中醫(yī)藥信息，2018，35（2）：1-5.

[5] 陶叢敏，冶娟，馬文宇，等.青海黑果枸杞原花青素對(duì)小鼠光老化皮膚的保護(hù)作用[J].實(shí)用皮膚病學(xué)雜志，2018，11（2）：74-77.

[6] 甘青梅，駱桂法，李普衍，等.藏藥黑果枸杞開(kāi)發(fā)利用的研究[J].青?？萍?，1997（1）：17-18.

[7] 馬繼雄.道地藥材黑果枸杞的應(yīng)用研究進(jìn)展及青海的發(fā)展前景[J].青海師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，28（3）：53-56.

[8] 陳?？?，蒲凌奎，曹君邁，等.黑果枸杞的研究現(xiàn)狀及其開(kāi)發(fā)利用[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（5）：155-157.

[9] NAGAOKA T， OGIHARA Y. Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers[J]. Theor Appl Genet，1997，94：597-602.

[10] 張盾，任夢(mèng)云，張銀東，等.基于ISSR分子標(biāo)記的野生山莨菪遺傳多樣性研究[J].中草藥，2018，49（1）：219-226.

[11] 董永梅，于航，李有忠，等.26份大豆品種（系）遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].分子植物育種，2018，16（15）：4964-4970.

[12] 朱田田，晉玲，黃得棟，等.野生與栽培當(dāng)歸遺傳多樣性比較[J].中草藥，2018，49（1）：211-218.

[13] 楊晴，楊菲，楊康，等.秦皇島產(chǎn)檉柳ISSR遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建[J].中草藥，2017，48（2）：363-367.

[14] DAI H Y， GUO W， ZHANG Y， et al. Genetic diversity of Crataegus pinnatifida Bge. as evaluated by RAPD and ISSR markers[J]. Acta Horticulturae Sinica，2008，35（8）：1117-1124.

[15] 朱田田，晉玲，張裴斯，等.基于ISSR的甘肅不同產(chǎn)區(qū)栽培當(dāng)歸遺傳多樣性研究[J].中草藥，2015，46（23）：3549-3556.

[16] 朱田田，晉玲，杜弢，等.中麻黃基因組DNA不同提取方法的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，40（4）：316-318.

[17] YEH F C， YANG R C， BOYLE T B J， et al. POPGENE， the user-friendly shareware for population genetic analysis[J]. Mol Biol Biot Centre，1997，10：295-301.

[18] ROHLF F J. NTSYS-pc：Numerical taxonomy and multivariate analysis system， version 2.1[M]. New York：Applied Biostatistics， 2000.

[19] 張盾，任夢(mèng)云，張銀東，等.基于ISSR分子標(biāo)記的野生山莨菪遺傳多樣性研究[J].中草藥，2018，49（1）：218-226.

[20] 張春平，何平，何俊星，等.ISSR分子標(biāo)記對(duì)金蕎麥8個(gè)野生居群的遺傳多樣性分析[J].中國(guó)中藥雜志，2010，41（11）：1881-1885.

[21] 阿力同·其米克，王青鋒，楊春鋒，等.新疆產(chǎn)藥用植物黑果枸杞遺傳多樣性的ISSR分析[J].植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2013，31（5）：517-524.

（收稿日期：2018-08-27）

（修回日期：2019-04-02;編輯：陳靜）