復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合順鉑對急性淋巴細(xì)胞白血病耐藥細(xì)胞株移植瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)酶表達(dá)的影響

呂鵬 趙歡 石鳳芹 陳信義 侯麗

摘要：目的 ?觀察復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合順鉑（CDDP）對急性淋巴細(xì)胞白血病耐藥細(xì)胞株（L1210/CDDP）移植瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)酶表達(dá)的影響，探討其抗急性淋巴細(xì)胞白血病的作用機(jī)制。方法 ?將急性淋巴細(xì)胞白血病多藥耐藥細(xì)胞株L1210/CDDP細(xì)胞接種于DBA/2小鼠腋前皮下構(gòu)建多藥耐藥移植瘤模型，成模后按隨機(jī)數(shù)字表法將移植瘤小鼠分為模型組、CDDP組、高劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組、中劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組、低劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組、中劑量復(fù)方浙貝顆粒組，分組當(dāng)日開始給藥，隔日1次，共14 d;實驗結(jié)束后處死小鼠，剝離腫瘤，將瘤塊組織制成切片，免疫組化檢測L1210/CDDP移植瘤細(xì)胞耐藥相關(guān)酶谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（GST）、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopⅡ）的表達(dá)。結(jié)果 ?與模型組和CDDP組比較，各劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組均能提高L1210/CDDP移植瘤的抑制率（P<0.05）;各組生存期比較，高劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組最優(yōu)，平均53.7 d（P<0.05），最長74 d;與模型組比較，CDDP組和中、高劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組GST表達(dá)均明顯降低（P<0.05），CDDP組、中劑量復(fù)方浙貝顆粒組和各劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組TopⅡ表達(dá)均明顯升高（P<0.05）;與CDDP組比較，中、高劑量復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合CDDP組GST表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01），復(fù)方浙貝顆粒高劑量聯(lián)合CDDP組TopⅡ表達(dá)明顯升高（P<0.05）。結(jié)論 ?復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合順鉑能提高L1210/CDDP移植瘤的腫瘤抑制率，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)腫瘤多藥耐藥相關(guān)酶GST/TopⅡ通路逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性，從而增加腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性。

關(guān)鍵詞：復(fù)方浙貝顆粒;急性淋巴細(xì)胞白血病;細(xì)胞增殖;多藥耐藥;小鼠

中圖分類號：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A ???文章編號：1005-5304（2019）11-0052-05

Abstract： Objective To explore the anti-tumor effects of Compound Zhebei Granules combined with cisplatin （CDDP） on mice with acute lymphoblastic leukemia cell line （L1210/CDDP）， and the expression of drug-resistant enzymes; To explore its mechanism of action against acute lymphoblastic leukemia. Methods Multidrug- resistant transplanted tumor model was established by inoculating acute lymphoblastic leukemia multidrug-resistant cell line L1210 CDDP subcutaneously in DBA/2 mice. The transplanted tumor mice were divided into model group， CDDP group， Compound Zhebei Granules high-dose combined with CDDP group， medium-dose combined with CDDP group， low-dose combined with CDDP group， and medium-dose Compound Zhebei Granules groups according to random number table method. Each group was given medication since the group were divided， every other day， for 14 d. The mice were sacrificed after the experiment， and the tumors were dissected into sections. The expression of drug resistance-related enzymes GST and TopⅡ in transplanted L1210 CDDP cell line was detected by immunohistochemistry. Results Compared with model group and CDDP group， Compound Zhebei Granulescombined with CDDP groups could increase the inhibition rate of transplanted L1210 CDDP cell line （P<0.05）. The survival time of Compound Zhebei Granules high-dose combined with CDDP group was the best （P<0.05）， with an average of 53.7 days and a maximum of 74 days. Compared with model group， GST of CDDP group and Compound Zhebei Granules high-dose combined with CDDP group， medium-dose combined with CDDP group decreased significantly （P<0.05）; TopⅡ in CDDP group and medium-dose Compound Zhebei Granules and other Compound Zhebei Granules combined with CDDP groups increased significantly （P<0.05）. Compared with CDDP group， the expression of GST in Compound Zhebei Granules high-dose and medium-dose group combined with CDDP group decreased significantly （P<0.05， P<0.01）， the expression of TopⅡ in Compound Zhebei Granules high-dose combined with CDDP group increased significantly （P<0.05）. Conclusion Compound Zhebei Granules combined with CDDP can improve the tumor inhibition rate of transplanted acute lymphoblastic leukemia drug-resistant cell lines. Its mechanism is to reverse multidrug resistance by regulating the GST/TopⅡ pathway of multidrug resistance-related enzymes， thereby increasing the sensitivity of cancer cells to drugs.

Keywords： Compound Zhebei Granules; acute lymphoblastic leukemia; cell proliferation; multidrug resistance; mice

急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）是造血系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，以克隆性增殖異常分化的惡性細(xì)胞浸潤骨髓、血液及其他組織為特點，化療、造血干細(xì)胞移植及生物靶向治療是其主要手段，白血病細(xì)胞對化療藥物耐藥是ALL復(fù)發(fā)和難治的重要因素[1-2]。有研究表明，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topoisomerase Ⅱ，TopⅡ）表達(dá)降低導(dǎo)致的多藥耐藥是ALL獨(dú)立的預(yù)后判斷及耐藥因素之一[3-4]。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）可通過增加藥物外排、直接參與細(xì)胞凋亡途徑等多途徑導(dǎo)致多藥耐藥，且TopⅡ與GST表達(dá)多呈負(fù)相關(guān)，抑制GST的活性及表達(dá)能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥[5-7]。中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥方面具有獨(dú)到優(yōu)勢。復(fù)方浙貝顆粒是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院血液腫瘤科遵循難治性急性白血病“痰瘀互阻”的基本病機(jī)而研制的復(fù)方制劑，處方由浙貝母、川芎、漢防己（1∶1∶1）組成。前期研究顯示，復(fù)方浙貝顆粒（Compound Zhebei Granule，CZBG）能通過多靶點多途徑逆轉(zhuǎn)急性髓系白血病細(xì)胞株動物模型小鼠對化療藥物的多藥耐藥性[8-11]。為進(jìn)一步闡明該復(fù)方在難治性ALL中的效應(yīng)機(jī)制，本研究以ALL多藥耐藥細(xì)胞株L1210/CDDP為靶細(xì)胞，建立小鼠移植瘤模型，在觀察腫瘤抑制率基礎(chǔ)上，從耐藥相關(guān)酶表達(dá)差異探究CZBG抗ALL作用及逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥機(jī)制。

1 ?實驗材料

1.1 ?動物

SPF級DBA/2小鼠150只，4周齡，雌雄各半，購于北京維通利華實驗動物公司，動物許可證號SYXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所SPF級動物實驗室，溫度（24±2）℃，相對濕度（50±10）%，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。空氣潔凈度100級，氨濃度≤14 mg/m3，噪聲≤60 dB，工作照度150～300 LX，動物照度100～200 LX。

1.2 ?細(xì)胞株

L1210/CDDP細(xì)胞株，購于上海美軒生物科技有限公司。

1.3 ?藥物及制備

CZBG浸膏粉，6.579 g原藥材/g，北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供;用純凈水配制CZBG浸膏粉，高劑量CZBG為61.56 mg/mL（相當(dāng)于臨床劑量18倍）;中劑量CZBG為35.78 mg/mL（相當(dāng)于臨床劑量9倍）;低劑量CZBG為17.89 mg/mL（相當(dāng)于臨床劑量4.5倍）。受試藥物于實驗當(dāng)日配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。注射用順鉑（CDDP）10 mg/支，齊魯制藥有限公司，批號20170802。

1.4 ?主要試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、青鏈霉素，美國Hyclone公司;胎牛血清（FBS），Gibco公司;細(xì)胞培養(yǎng)箱（240i），Thermo公司;顯微鏡（ckx53），日本Olympus公司;移液槍，美國Eppendorf公司;負(fù)壓超凈工作臺（FCH-1300B），北京亞太科隆公司;電子天平（BSA3202S-CW），美國梅特勒-托利多公司。Anti-GST3/GST pi抗體[EPR8263]（ab138491），Anti-Topoisomerase Ⅱ alpha抗體[EP1102Y]（ab52934）。切片機(jī)（德國Leica公司，型號RM2016/1404014），烤片機(jī)（天津天利航空機(jī)電有限公司，型號KPJ-1A/11030574），攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號KD-P/51230），顯微鏡（NATIONAL，型號B2-220），高壓鍋、電磁爐、冰箱、隔水式恒溫箱。

2 ?實驗方法

2.1 ?造模

L1210/CDDP細(xì)胞用含0.2 μg/mL CDDP、10%FBS、1%雙抗RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持耐藥。接種前2周置于不含CDDP完全培養(yǎng)基37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2～3 d換液1次。

收集對數(shù)生長期細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，無血清RPMI1640培養(yǎng)液稀成濃度為1×107個/mL的細(xì)胞懸液。于小鼠右前腋側(cè)皮下注射1×106個細(xì)胞。

2.2 ?分組和給藥

小鼠接種L1210/CDDP 6 d后，成瘤小鼠測量腫瘤最大徑（a）和最小徑（b），按公式V=ab2÷2計算腫瘤體積，剔除腫瘤體積過大及過小小鼠38只，余下96只小鼠腫瘤體積平均約220～230 mm3，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、CDDP組、高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組、中劑量CZBG聯(lián)合CDDP組、低劑量CZBG聯(lián)合CDDP組、中劑量CZBG組，每組16只。分組當(dāng)日開始給藥，其中模型組小鼠給予生理鹽水腹腔注射+純凈水灌胃1次/d（0.2 mL/10 g）;CDDP組小鼠給予純凈水灌胃1次/d（0.2 mL/10 g）+CDDP 1 mg/kg腹腔注射[按臨床化療方案100 mg/（m2·d）成人用量換算（下同）]，隔日1次;高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組小鼠給予CZBG灌胃10 g/（kg·d）+CDDP 1 mg/kg腹腔注射，隔日1次;中劑量CZBG聯(lián)合CDDP組小鼠給予CZBG灌胃5 g/（kg·d）+CDDP 1 mg/kg腹腔注射，隔日1次;低劑量CZBG聯(lián)合CDDP組給予CZBG灌胃2.5 g/（kg·d）+CDDP 1 mg/kg腹腔注射，隔日1次;中劑量CZBG組小鼠給予CZBG灌胃5 g/（kg·d），共干預(yù)14 d。通過人和動物間體表面積等效劑量比進(jìn)行藥量換算。

2.3 ?瘤重及抑瘤率測定

末次給藥后12 h，脫頸處死每組10只小鼠（雌雄各半），稱重后完整剝離小鼠移植瘤組織，測量小鼠瘤塊體積并稱重，根據(jù)瘤質(zhì)量計算各實驗組抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-試驗組瘤質(zhì)量÷對照組瘤質(zhì)量）×100%。

2.4 ?生存期測定

末次給藥后12 h，脫頸處死每組10只小鼠（雌雄各半），各組余下6只小鼠（雌雄各半）用于觀察生存期。

2.5 ?多藥耐藥相關(guān)酶免疫組化檢測

將各實驗組小鼠腫瘤組織進(jìn)行石蠟包埋，切片，脫蠟脫水后，采用免疫組化SP二步法（實驗操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行）檢測TopⅡ、GST?？乖瓱嵝迯?fù)3 min，切片浸入0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加3%H2O2，10～15 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加一抗（GST、TopⅡ抗體，l∶100稀釋），37 ℃濕盒孵育90 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，滴加二抗（生物素標(biāo)記辣根過氧化物酶標(biāo)記抗鼠IgG抗體），37 ℃濕盒孵育90 min，0.01 mol/L PBS洗滌3次×2 min，DBA顯色劑顯色15 min，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固，用PBS代替一抗作陰性對照。TopⅡ及GST染色陽性物質(zhì)主要定位于細(xì)胞漿及細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，應(yīng)用Image ProlPus 6.0免疫組化彩色圖像分析系統(tǒng)對免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行定量分析，以對照組陽性點為基礎(chǔ)，對視野統(tǒng)一測定參數(shù)，分析實驗各組圖片陽性點積分光密度與細(xì)胞分布區(qū)域面積之比（IOD/Area），反映免疫組化圖片中目標(biāo)蛋白平均表達(dá)量。

3 ?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0和Grapad Prism 7.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，組間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 ?結(jié)果

4.1 ?瘤質(zhì)量和抑瘤率比較

與模型組比較，中劑量CZBG聯(lián)合CDDP組、高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組小鼠瘤質(zhì)量明顯降低（P<0.05，P<0.01）;CDDP組、中劑量CZBG組、低劑量CZBG聯(lián)合CDDP組小鼠瘤質(zhì)量較模型組無明顯變化（P>0.05）。高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組小鼠抑瘤率最佳。結(jié)果見表1。

4.2 ?生存期比較

與模型組比較，高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其余各組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;各組生存期比較：高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組>低劑量CZBG聯(lián)合CDDP組>中劑量CZBG聯(lián)合CDDP組>CDDP組>中劑量CZBG組>模型組，見圖1。

4.3 ?復(fù)方浙貝顆粒聯(lián)合順鉑對移植瘤細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

免疫組化標(biāo)記的GST、TopⅡ呈棕黃色，主要存在于細(xì)胞漿及細(xì)胞核中。鏡下顯示，模型組可見較多GST表達(dá)細(xì)胞，CDDP組、中劑量CZBG組及各劑量CZBG聯(lián)合CDDP組GST表達(dá)細(xì)胞減少，見圖2;TopⅡ表達(dá)細(xì)胞在模型組中較少，中劑量CZBG組、CDDP組及各劑量CZBG聯(lián)合CDDP組TopⅡ表達(dá)細(xì)胞增多，見圖3。與模型組比較，CDDP組及中、高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組GST表達(dá)明顯降低（P<0.05），CDDP組、中劑量CZBG組及各劑量CZBG聯(lián)合CDDP組TopⅡ表達(dá)明顯升高（P<0.05）;與CDDP組比較，高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組TopⅡ表達(dá)明顯升高（P<0.05），中、高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組GST表達(dá)明顯降低（P<0.05，P<0.01），見表2。

5 ?討論

惡性腫瘤多藥耐藥迄今研究多集中在多藥耐藥基因（MDR1）及其編碼的糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP1-6）方向。越來越多研究表明，多藥耐藥相關(guān)酶如GST、TopⅡ的表達(dá)異常在惡性腫瘤，特別是復(fù)發(fā)及難治性白血病細(xì)胞中具有重要作用[12-15]。研究表明，TopⅡ在復(fù)發(fā)的急性白血病中明顯降低，TopⅡ介導(dǎo)的多藥耐藥常表現(xiàn)為耐藥細(xì)胞酶轉(zhuǎn)錄水平和活性降低，同時伴有細(xì)胞內(nèi)藥物濃度下降，TopⅡ表達(dá)降低是ALL獨(dú)立的預(yù)后判斷及耐藥因素之一[3-4]。TopⅡ與GST在惡性腫瘤中呈負(fù)相關(guān);此外，GST可通過增加藥物外排、直接參與細(xì)胞凋亡途徑導(dǎo)致耐藥及HNE等多途徑導(dǎo)致多藥耐藥，抑制GST的活性及表達(dá)可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥[5-7]。

中醫(yī)藥在逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞多藥耐藥方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[16]，難治性急性白血病久治不愈，類似中醫(yī)“頑痰”特征，淋巴結(jié)腫大符合中醫(yī)學(xué)“痰核”“瘰疬”特點，皮膚瘀點、瘀斑等符合中醫(yī)“血瘀”表現(xiàn)。司富春等[17]基于文獻(xiàn)的證候要素分析顯示，痰瘀互阻是白血病的主要病機(jī)。根據(jù)中醫(yī)辨證論治原則，基于急性白血病痰瘀互阻的證候特點配伍的CZBG具有化痰散結(jié)、活血化瘀功效，方中浙貝母化痰散結(jié)，川芎行氣活血化瘀，漢防己利濕消腫以截生痰之源，合用以消難治性AIL“頑痰”，行氣活血以散“血瘀”。基礎(chǔ)研究顯示，CZBG可通過多靶點多途徑逆轉(zhuǎn)急性髓系白血病細(xì)胞株動物模型小鼠對化療藥物的多藥耐藥性[8-11]。

本研究結(jié)果顯示，與模型組和CDDP組比較，各劑量CZBG聯(lián)合CDDP組均能提高ALL耐藥細(xì)胞株L1210/CDDP移植瘤的抑瘤率（P<0.05）;各組生存期比較，高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組>低劑量CZBG聯(lián)合CDDP組>中劑量CZBG聯(lián)合CDDP組>CDDP組>中劑量CZBG組>模型組。其中，高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組能明顯延長移植瘤小鼠生存期（P<0.05）。與模型組比較，CDDP組和中、高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組GST表達(dá)均有不同程度降低（P<0.05）;與CDDP組比較，中、高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組GST表達(dá)也明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，CDDP組、中劑量CZBG組及各劑量CZBG聯(lián)合CDDP組TopⅡ均有不同程度升高（P<0.05）;與CDDP組比較，高劑量CZBG聯(lián)合CDDP組TopⅡ表達(dá)明顯升高（P<0.05）。與CDDP組比較，CZBG聯(lián)合CDDP能提高ALL耐藥細(xì)胞株移植瘤腫瘤抑制率，其機(jī)制為通過調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)酶GST/TopⅡ通路來逆轉(zhuǎn)ALL細(xì)胞的多藥耐藥，從而增加白血病細(xì)胞對藥物的敏感性。

急性白血病分為急性髓系白血病和ALL。結(jié)合前期基礎(chǔ)研究基于急性髓系白血病多藥耐藥細(xì)胞株探索CZBG的抗白血病作用及逆轉(zhuǎn)其多藥耐藥機(jī)制[8-11]，本研究基于ALL多藥耐藥細(xì)胞株探索CZBG抗白血病作用及其機(jī)制，進(jìn)一步豐富了臨床驗方CZBG在復(fù)發(fā)及難治性急性白血病中的作用探討及機(jī)制研究。

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（收稿日期：2019-05-29）

（修回日期：2019-06-17;編輯：華強(qiáng)）