不同菌種固態(tài)發(fā)酵對普洱茶化學成分和感官品質的影響

單治國，張春花*，周紅杰，強繼業(yè)

（1.普洱學院，云南普洱 665000；2.云南農業(yè)大學，云南昆明 650201）

普洱茶是以地理標志保護范圍內的云南大葉種［Camelliasinensis（Linn.）var.assamica（Masters）Kitamura］的曬青毛茶為原料，并在地理標志保護范圍內采用特定的加工工藝（微生物固態(tài)發(fā)酵）制成。其熟茶獨特品質特征為：外形色澤紅褐，內質湯色紅濃明亮，香氣獨特陳香，滋味醇厚回甘，葉底紅褐［1］。因獨特的陳香和保健功效，近年來備受國內外消費者關注。

有益微生物的發(fā)酵作用在普洱茶品質形成中起決定性的作用［2，3］，是普洱茶品質形成的必要條件，離開了有益微生物和濕熱作用，云南大葉種曬青毛茶難以形成普洱茶特有品質風格［4］。目前關于有益菌固態(tài)發(fā)酵對普洱熟茶化學成分和感官品質方面的影響研究在國內外鮮有報道。周紅杰［5］研究表明，在渥堆過程的不同時期，黑曲霉、青霉屬、根霉屬、酵母屬、米曲霉等微生物大量生長并占據微生物種群的主要地位。陳宗道研究發(fā)現(xiàn)［6］，普洱茶渥堆過程中存在有黑曲霉（Aspergillus niger）、灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）、青霉（Penicillium sp）、根霉（Rhizopussp）和酵母（Saccharomyces sp.）等微生物，并認為黑曲霉約占微生物總數的80%左右。羅龍新、馬靜等研究認為［7］，在普洱茶加工過程中存在有霉菌和酵母菌。韓俊等［8］在針對普洱茶加工過程中微生物及酶系變化的研究中，發(fā)現(xiàn)黑曲霉、青霉、根霉、灰綠曲霉和酵母等微生物存在于普洱茶的整個加工過程中。陳宗道與劉勤晉［9］等的研究均提出微生物分泌的胞內酶（多酚氧化酶、抗壞血酸酶、過氧化物酶等）及呼吸代謝產生的熱量對普洱茶品質形成起著非常重要的作用。渥堆過程中茶葉的內含物成分發(fā)生一系列的反應，并生成更為復雜但對普洱茶品質有利的產物［10］。多酚氧化酶與黑曲霉的增長呈高度正相關，與微生物群落的總量消長也呈同一趨勢［11］。同時，在微生物胞外酶酶促作用和濕熱作用以及微生物內代謝作用下，以茶多酚［12］、氨基酸、糖類、嘌呤堿等為主體的滋味物質發(fā)生了氧化、聚合、降解、分解、轉化，使得兒茶素（尤其是酯型兒茶素）和氨基酸總量減少及內部配比的改變（尤其是人體必需的8種氨基酸的增加），主要表現(xiàn)為可溶性糖的減少、單糖、雙糖配比的改變以及嘌呤堿內部的相互轉化，從而使這些鮮、甜、酸、澀、苦、醇味物質，通過消殺、變調、相柔、阻礙等作用，最終綜合協(xié)調形成了醇和的品質特點。王增盛［13］研究表明強烈的水熱作用及微生物分泌的各種胞外酶的作用，茶葉中固有的揮發(fā)性香氣成分和各種香氣物質（如糖類、氨基酸、脂肪、類胡蘿卜素、萜烯甙、兒茶素及其氧化產物等）發(fā)生轉化、異構、降解、聚合、偶聯(lián)等反應，形成了以萜烯醇類和酚類為主體的香氣組分配比。普洱茶香氣成分的重要特色在于渥堆過程中形成了大量芳香族化合物［14］，如1，2，3-三甲氧基苯、1，2-二甲氧基苯等；而固態(tài)發(fā)酵茶中的許多有典型霉味和陳香的物質，可能是相應化合物通過霉菌的作用而發(fā)生甲基化反應形成的［15］。

普洱茶渥堆過程中微生物菌種的變化是極其復雜的，有的微生物自始至終對普洱茶品質的形成發(fā)揮著重要積極的作用，有的微生物卻是在普洱茶加工的某一階段發(fā)揮著形成普洱茶獨特風格的作用，有的微生物的產生則不利于普洱茶品質的形成。本研究探討了授權專利菌種（綠色木霉Trichoderma viride Pers.ex Fr.、黑曲霉Aspergillus niger van Tieghem、少根根霉Rhizopus arrhizus Fischer、釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae）固態(tài)發(fā)酵對普洱熟茶化學成分和感官品質的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種及來源

少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母、綠色木霉，均由云南農業(yè)大學普洱茶研究院分離、純化、鑒定、保存、篩選、擴繁而得，并獲授權專利。

1.2 實驗材料

材料：云南農業(yè)大學普洱茶研究院采用臨滄地區(qū)云南大葉種茶樹（Camellia Sinensis（Linn.）Var.assamica（masters）Kitamura）鮮葉制成的曬青毛茶以及使用該毛茶分別接種四種有益菌種固態(tài)發(fā)酵而制成的普洱茶。

1.3 試驗方法

用小型噴霧器將四種有益菌種（少根根霉、黑曲霉、釀酒酵母、綠色木霉），按液茶比為1︰10的比例均勻灑在曬青毛茶上進行普洱茶固態(tài)發(fā)酵，重復3次，控制發(fā)酵茶堆溫度在40-60℃，濕度在35%，發(fā)酵環(huán)境溫度在25℃，環(huán)境濕度在80%，翻堆6次，共計發(fā)酵55天。

1.4 分析方法

水浸出物含量測定:GB/T 8305-2002;茶多酚(TPs)總量測定:GB/T 8313-2002;游離氨基酸總量測定:GB/T 8314-2002;咖啡堿的測定：GB/T 8312-2002;可溶性總糖的測定:蒽酮比色法;黃酮類化合物總量的測定——三氯化鋁比色法[16]；茶紅素(TR)、茶褐素(TB)：比色系統(tǒng)分析法[16]。

1.5 數據處理及分析

SPSS數據處理系統(tǒng)軟件;差異顯著性通過Duncan新復極差測驗(SSR法)進行統(tǒng)計分析,結果采用字母表示法[17]。

1.6 感官審評方法

實驗樣3.0g，用150mL沸水沖泡，靜置5min，重復3次［18，19］，密碼審評各茶樣的香氣、滋味與湯色，用評分與評語相結合的方法反映其品質。評分采用百分制，每5分為一檔，2～3分為半檔。

2 結果與分析

2.1 主要化學成分的變化

對茶樣的水浸出物、茶多酚、氨基酸、咖啡堿、黃酮、茶黃素、茶紅素、茶褐素含量的測定結果分析如表1。

表1 不同有益菌固態(tài)發(fā)酵對普洱茶化學成分的影響Tab.1 Effects of Different Beneficial Microorganisms Solid State Fermentation on Chemical Compositions of Pu-erh Tea 單位：%（以干基計）unit%

2.1.1 水浸出物含量的變化

普洱茶中的水浸出物是茶湯的主要呈味物質，水浸出物含量的高低反映了普洱茶中可溶出物的多少，標志著茶湯的厚薄、滋味的濃強程度，從而在一定程度上反映普洱茶品質的優(yōu)劣。水浸出物含量高則味濃，反之則淡。水浸出物含量大于40%，說明普洱茶內含物相當豐富，也為普洱茶滋味的濃醇和耐沖泡奠定了物質基礎。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，水浸出物的含量呈下降趨勢，下降幅度從大到小依次是：少根根霉＞釀酒酵母＞黑曲霉＞綠色木霉，且成品普洱茶中水浸出物含量差異達到極顯著（P＜0.01），接種綠色木霉發(fā)酵的普洱茶水浸出物含量明顯的高于其他三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，且達到40.82%，滋味濃醇。

2.1.2 茶多酚含量的變化

茶多酚是形成普洱茶品質的重要活性物質,在茶湯中呈苦澀,有較強的刺激性，對茶葉的色、香、味都有很大的影響，在加工過程中發(fā)生一系列水解、異構、氧化、聚合等反應，使茶湯滋味變得濃強或醇和。普洱茶的多酚類物質大致可分為未被氧化的多酚類物質（主要是殘留兒茶素）、水溶性的氧化產物（主要是TF、TR、TB）和非水溶性的氧化產物（主要是與蛋白質結合的不溶性大分子物質）三大部分。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，茶多酚含量呈下降趨勢，下降幅度從大到小依次是：少根根霉＞綠色木霉＞黑曲霉＞釀酒酵母。接種釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶中茶多酚含量高于其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，差異達極顯著（P＜0.01）；接種綠色木霉、黑曲霉發(fā)酵的普洱茶中茶多酚含量差異不顯著，滋味醇厚甘滑；接種少根根霉發(fā)酵的普洱茶中茶多酚含量低于其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，差異達極顯著（P＜0.01），滋味甘醇。

表2 不同有益菌固態(tài)發(fā)酵對普洱茶感官品質的影響Tab.2 Effects of Different Beneficial Microorganisms Solid State Fermentation on Organoleptic Quality of Pu-erh Tea

2.1.3 氨基酸總量的變化

茶葉氨基酸的組成、含量以及降解產物和轉化產物直接影響茶葉品質，主要是影響茶葉的香氣和滋味，它與多酚類混合在一起，能增進茶葉的鮮爽味。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，氨基酸含量呈下降趨勢，下降幅度從大到小依次是：綠色木霉＞黑曲霉＞釀酒酵母＞少根根霉。接種少根根霉發(fā)酵的普洱茶中氨基酸含量低于其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，差異達極顯著（P＜0.01）；接種綠色木霉、釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶中氨基酸含量差異不顯著，且含量超過2.00%，滋味在鮮爽度和回甘度方面好于其他二種有益菌發(fā)酵的普洱茶。

2.1.4 咖啡堿含量的變化

咖啡堿是普洱茶生物活性物質之一，也是構成普洱茶茶湯滋味的重要呈味物質，對普洱茶的品質有重要作用，適量的咖啡堿使滋味鮮爽，而過量則使茶湯帶苦味。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，咖啡堿的含量呈增加趨勢，增加幅度從大到小依次是：少根根霉＞黑曲霉＞綠色木霉＞釀酒酵母。普洱茶中咖啡堿含量差異達到極顯著（P＜0.01），接種綠色木霉發(fā)酵的普洱茶咖啡堿含量明顯的高于其他三種有益菌發(fā)酵的普洱茶。

2.1.5 黃酮含量的變化

茶葉中的黃酮類化合物主要是黃酮醇及其苷類，是構成茶黃素的重要組分[20，21]，能溶于熱水，對茶的色澤和滋味都有一定的影響。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，黃酮的含量呈增加趨勢，增加幅度從大到小依次是：少根根霉＞黑曲霉＞綠色木霉＞釀酒酵母。接種少根根霉發(fā)酵的普洱茶中黃酮含量高于其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，差異達極顯著（P＜0.01）；接種綠色木霉、釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶中黃酮含量差異不顯著，與其他兩種有益菌發(fā)酵的普洱茶中黃酮含量差異達極顯著（P＜0.01）。

2.1.6 水溶性灰分的變化

灰分中能溶于沸水的部分稱之為水溶性灰分，水溶性灰分與茶葉品質呈正相關，水溶性灰分含量高，或占總灰分的比率大是茶葉品質好的象征。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，從原料至固態(tài)發(fā)酵結束，水溶性灰分的含量呈增加趨勢，增加幅度從大到小依次是：黑曲霉＞綠色木霉＞少根根霉＞釀酒酵母。接種黑曲霉發(fā)酵的普洱茶中水溶性灰分含量高于其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，差異達極顯著（P＜0.01）；接種綠色木霉、少根根霉發(fā)酵的普洱茶中水溶性灰分含量差異不顯著，與其他兩種有益菌發(fā)酵的普洱茶中水溶性灰分含量差異達極顯著（P＜0.01）。

2.1.7 可溶性糖的變化

可溶性糖具有甜味，是構成茶湯滋味和香氣的因素之一，它們是茶湯甜味的主要組成部分，它不僅使茶葉滋味甜醇，而且對咖啡堿的苦澀味具有一定的抑制和協(xié)調作用，可溶性糖含量越高，茶葉滋味越甘醇而不苦澀。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，從原料至固態(tài)發(fā)酵結束，可溶性糖分的含量呈增加趨勢，增加幅度從大到小依次是：少根根霉＞黑曲霉＞綠色木霉＞釀酒酵母。接種少根根霉發(fā)酵的普洱茶中可溶性糖含量高于其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，差異達極顯著（P＜0.01），滋味甘醇；接種綠色木霉、黑曲霉發(fā)酵的普洱茶中可溶性糖含量差異不顯著，與其他兩種有益菌發(fā)酵的普洱茶中可溶性糖含量差異達極顯著（P＜0.01）。

2.1.8 茶色素含量變化

普洱茶主要色素物質是茶黃素、茶紅素、茶褐素，目前認為這三種色素是茶多酚的主要水溶性氧化產物，茶黃素是茶湯“亮”的主要成分；茶紅素是茶湯“紅”的主要成分；茶褐素是茶湯“褐”的主要成分［22］。從表1，表2可知：與曬青毛茶原料（CK）樣相比，在四種有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）的作用下，從原料至固態(tài)發(fā)酵結束，茶紅素的含量呈下降趨勢，下降幅度從大到小依次是：釀酒酵母＞綠色木霉＞黑曲霉＞少根根霉；茶褐素含量呈增加趨勢，增加幅度從大到小依次是：黑曲霉＞綠色木霉＞少根根霉＞釀酒酵母。接種綠色木霉、釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶中茶紅素含量差異不顯著，與其他兩種有益菌發(fā)酵的普洱茶中茶紅素含量差異達極顯著（P＜0.01）；接種黑曲霉發(fā)酵的普洱茶中茶褐素含量高于其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶，差異達極顯著（P＜0.01）；其他三種有益菌發(fā)酵的普洱茶中茶褐素含量差異不顯著。

2.2 感官評審結果

從表2可知：用有益菌（綠色木霉、黑曲霉、少根根霉、釀酒酵母）固態(tài)發(fā)酵的普洱茶從原料到出堆樣外形差異不明顯，內質上有一定的差異，主要表現(xiàn)在滋味和香氣方面。用綠色木霉發(fā)酵的普洱茶滋味濃醇回甘，香氣陳香透花-木香；黑曲霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚，陳香透花果香；少根根霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚甘滑，陳香濃；釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶滋味醇和甘滑，香氣陳香較顯，這與理化成分含量分析相吻合。

經方差分析表明：接種綠色木霉、黑曲霉發(fā)酵的普洱茶品質之間差異不顯著，與釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶品質間差異達極顯著（P＜0.01）；接種少根根霉發(fā)酵的普洱茶品質與其它三種有益菌發(fā)酵的普洱茶差異達極顯著（P＜0.01）。

3 結論與討論

3.1 綠色木霉發(fā)酵的普洱茶滋味濃醇回甘，香氣陳香透花木香，與其他三種微生物固態(tài)發(fā)酵相比水浸出物、氨基酸、咖啡堿的含量最高，分別是40.82%，2.33%，4.60%。綠色木霉能分泌酶類作用于基質，可抑制其他雜菌的生成，并能與其他菌種配合發(fā)揮良好的作用，促進普洱茶“濃醇”品質的形成。

3.2 黑曲霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚，陳香透花果香，與其他三種微生物固態(tài)發(fā)酵相比茶褐素含量最高，12.24%。普洱茶品質與綠色木霉發(fā)酵的差異不顯著。黑曲霉在發(fā)酵過程中可分泌胞內和胞外兩類酶系。普洱熟茶固態(tài)發(fā)酵過程中，黑曲霉產生的胞外酶可把發(fā)酵茶葉中不溶解的有機物水解為可溶的，把生物大分子有機物催化水解成便于微生物吸收和利用的小分子有機物。被分解的有機物質包括多糖、脂肪、蛋白質、天然纖維素、半纖維素、果膠和不可溶性碳水化合物等，水解產物大多為單糖、寡糖、氨基酸、水化果膠和可溶性碳水化合物等。從而使茶葉內含物質的有效成分易于滲出，為增強普洱茶茶湯滋味提供了前提條件，是形成普洱茶甘滑、醇厚的物質基礎［23］。

3.3 少根根霉發(fā)酵的普洱茶滋味醇厚甘滑，陳香濃，與其他三種微生物固態(tài)發(fā)酵相比可溶性糖含量最高，6.07%。根霉在固態(tài)發(fā)酵中能產生糖化酶、果膠酶、蛋白酶等。這些酶及其代謝產物的出現(xiàn)有利于普洱茶粘滑和醇厚品質的形成。

3.4 釀酒酵母發(fā)酵的普洱茶滋味醇和甘滑，香氣陳香較顯，與其他三種微生物固態(tài)發(fā)酵相比茶多酚、氨基酸、茶紅素含量最高，分別是11.41%，2.37%，2.43%。酵母菌分泌酶類可發(fā)揮生物催化作用，將在制茶中不溶或難溶的大分子化合物轉化為易溶于水的小分子化合物。據周紅杰等［24］研究認為在水分適度時，大量釀酒酵母的生長對普洱茶甜醇滋味的形成有重要作用。

茶葉中水浸出物是指能被水浸泡出的物質，是茶湯的主要呈味物質，標志著茶湯的厚薄、滋味的濃強程度。發(fā)酵過程中水浸出物的含量是減少的，這可能是因為微生物的大量生長消耗了一些可溶性物質，同時不溶性的物質（不溶性茶多酚）則有所增加。

咖啡堿是茶葉中主要的嘌呤堿，是構成茶湯的重要滋味物質，與普洱茶品質呈正相關?？Х葔A的含量在普洱茶發(fā)酵過程中呈增加趨勢?？Х葔A含量的增加主要是微生物的作用。已有研究表明，在茶葉發(fā)酵過程中，霉菌可以增加咖啡堿的含量，而酵母則降低其含量。而且在霉菌中，黑曲霉的作用最大，其可以顯著增加咖啡堿的含量［25］。

氨基酸是構成茶湯滋味的重要化學成分，能增強茶葉的鮮爽味。氨基酸在普洱茶發(fā)酵的特殊溫濕條件下發(fā)生氧化、降解和轉化，與多酚類起反應生成褐色色素，還可以與碳水化合物發(fā)生梅拉德反應，聚合形成大分子的不溶性黑色素。因此，在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中氨基酸總體呈減少趨勢。

普洱茶中的多糖類主要有2個來源：一是茶葉本身所固有的和在“固態(tài)發(fā)酵”過程中微生物所轉化的，二是由微生物代謝所生成的，如酵母菌的細胞壁含有甘露聚糖、葡聚糖成分等［2］。在發(fā)酵初期，可溶性糖有所增加；然而，由于微生物的大量繁殖，作為微生物碳源的可溶性糖的消耗也隨之增加，而可被分解的碳水化合物則逐漸減少。同時，由于可溶性糖還可與氨基酸產生梅拉德反應，因此，在渥堆的后期可溶性糖含量便逐漸減少。

微生物固態(tài)發(fā)酵是普洱茶加工的關鍵工序，對普洱茶品質的形成具有重要意義。它是以曬青毛茶的內含成分為基質，在微生物分泌的胞外酶（多酚氧化酶、抗壞血酸酶等）的酶促作用、微生物呼吸代謝產生的熱量和茶葉水分的濕熱作用的協(xié)同下，發(fā)生以茶多酚轉化為主體的一系列復雜而劇烈的化學變化，從而實現(xiàn)普洱茶特有的色、香、味［22］。微生物生命活動和代謝是普洱茶品質風味形成的重要影響因子。目前國內外學者對普洱茶渥堆的研究還只是停留在菌種篩選，溫度、水分等環(huán)境條件［26］以及發(fā)酵時間［27］對普洱茶發(fā)酵的影響這幾個方面。但不同微生物到底對普洱茶發(fā)酵造成什么樣的影響，對促進普洱茶特征成分的變化有什么樣的作用，目前還沒有研究清楚。普洱熟茶微生物固態(tài)發(fā)酵的一系列反應中，微生物的參與起到了極為關鍵的重要作用，有益微生物參與發(fā)酵的作用機理仍需要進一步的深入研究。