微RNA-29b在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究

高英英

急性心肌梗死是冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死［1］。近年來，隨著各地區(qū)胸痛中心的建立以及溶栓治療、支架植入術(shù)的進(jìn)步，急性心梗病人的病死率明顯降低［2］。但是，由于尚無有效改善冠狀動脈血管再灌注損傷的治療方案，急性心梗病人的預(yù)后受到影響。因此，本實(shí)驗(yàn)探究小分子RNA在心肌缺血再灌注損傷中的作用，進(jìn)一步闡明心肌缺血再灌注損傷的病理過程，為臨床治療心肌缺血再灌注損傷提供思路。

既往研究表明組織缺血再灌注損傷的潛在機(jī)制主要包括自由基損傷，鈣超載，白細(xì)胞激活和微血管損傷等病理過程［3-5］。這些病理過程會造成大量心肌細(xì)胞的凋亡和壞死，但是也為臨床治療提供新的靶點(diǎn)。因此，深入研究心肌缺血再灌注損傷的病理過程對減少急性心肌梗死病人PCI植入術(shù)后再灌注損傷具有重要價(jià)值。

微RNA（miRNA）是短的單鏈RNA序列（通常為19～23個(gè)核苷酸），廣泛表達(dá)于生物系統(tǒng)中，其作用為控制基因在多種生理和病理過程中的表達(dá)，因此在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中具有關(guān)鍵作用［6-7］。Huang Z等［8］的研究結(jié)果表明miR-29b通過作用于位于1q21區(qū)域的myeloid cell leukemia-1（MCL-1）蛋白從而調(diào)控腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，然而尚沒有文獻(xiàn)報(bào)道其在心肌缺血再灌注損傷中的作用，因此在本實(shí)驗(yàn)中我們檢測了miR-29b在心肌缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion，I/R）損傷時(shí)的表達(dá)變化，同時(shí)通過上調(diào)其表達(dá)水平明確探討其在心肌缺血再灌注損傷中的作用。

本研究于2018年2月至2019年2月成功構(gòu)建了缺血再灌注細(xì)胞模型以及心肌缺血再灌注動物模型，通過上調(diào)miR-29b表達(dá)，觀察miR-29b能否影響缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡水平，并進(jìn)一步明確miR-29b在缺血再灌注損傷中發(fā)揮心臟保護(hù)作用的具體信號通路，從而闡明miR-29b在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與動物H9C2心肌細(xì)胞系購于上海生化細(xì)胞所，于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。30只健康清潔級雄性C57/B6小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量范圍為16～18 g，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 主要試劑miR-29b類似物（mimic）、NC miRNA、miR-29b激動劑（agomir）購于廣州銳博生物有限公司，叔丁基過氧化氫（TBHP）購于美國sigma公司，兔抗小鼠BCL2-Associated X的蛋白質(zhì)（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（BCL-2）單克隆抗體均購于Abcam公司；兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、蛋白激酶B（Akt）單克隆抗購于CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG均購于Bioworld公司；人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）購于伯信生物公司；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色試劑購于Solarbio公司；總RNA提取試劑盒（東洋紡）以及miR-29b、GAPDH引物購于伯信生物公司；實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）儀購于Eppendorf公司。

1.3 主要方法通過100 μmol/L TBHP誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞損傷構(gòu)建I/R細(xì)胞模型；分別設(shè)立正常對照組，TBHP處理組，NC miRNA處理組，miR-29b mimic處理組。通過qPCR檢測各組心肌細(xì)胞內(nèi)miR-29b表達(dá)量；CCK-8檢測各組心肌細(xì)胞的存活率；蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測心肌細(xì)胞中凋亡蛋白和蛋白激酶B（Akt）蛋白磷酸化水平的改變。另一方面，將30只C57/B6小鼠（6～7周齡）逐個(gè)編號，按隨機(jī)數(shù)字表法分為三組：I/R組、NC miRNA處理組和miR-29b agomir處理組，其中miR-29b agomir組小鼠預(yù)先給予miR-29b agomir治療。結(jié)扎冠狀動脈左前降支30 min，然后再灌注4 h建立心肌缺血再灌注動物模型。通過埃文斯藍(lán)（Evans）和TTC雙重染色評估三組小鼠心肌梗死面積；qPCR檢測各組小鼠心肌組織內(nèi)miR-29b表達(dá)量；蛋白質(zhì)印跡法檢測各組小鼠心肌組織內(nèi)凋亡蛋白改變。

1.3.1 細(xì)胞活性測定 將H9C2心肌細(xì)胞以每孔5 000個(gè)細(xì)胞濃度接種于96孔板中，然后暴露于不同濃度的TBHP12 h后，通過CCK-8測定細(xì)胞存活率，選擇最為合適的TBHP濃度用于心肌細(xì)胞模型構(gòu)建。另一方面，通過上調(diào)miR-29b表達(dá)量明確其對于心肌細(xì)胞活性的影響。CCK-8的具體方法為：將CCK-8染料加入每個(gè)孔中并孵育3 h。通過評估490 nm處的吸光度來測量存活細(xì)胞數(shù)。為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性，將CCK-8測定重復(fù)3次。

1.3.2 細(xì)胞及動物模型構(gòu)建 通過CCK-8摸索適宜濃度TBHP構(gòu)建缺血再灌注細(xì)胞模型。通過吸入異氟烷麻醉C57/B6小鼠，暴露氣管，小動物呼吸機(jī)輔助呼吸，從左側(cè)第4肋間進(jìn)入胸腔，用7-0滑線結(jié)扎冠狀動脈左前降支30 min，然后解開結(jié)扎線，冠狀動脈再灌注4 h，建立心肌缺血再灌注動物模型。再灌注4 h后處死各組小鼠，部分心臟儲存于-80℃冰柜內(nèi)，部分心臟用于TTC染色。

1.3.3 qPCR檢測mRNA表達(dá)量 取出放置于-80℃保存的各組心肌組織，提取心肌組織中總RNA并測定總RNA濃度及純度，按東洋紡逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，通過Eppendorf MAS熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測，以U6為參照，目的基因的相對含量以2-ΔΔCt表示，引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測p-Akt、Akt、Bax和BCL-2的蛋白水平 通過細(xì)胞裂解液降解心肌組織及心肌細(xì)胞蛋白，離心后取上清測定蛋白含量，經(jīng)凝膠電泳分離和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后分別加一抗GAPDH（1∶5 000）、p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）和 BCL-2（1∶1 000），4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，含吐溫的三乙醇胺緩沖鹽水溶液（tris buffered saline+tween 20，TBST）洗膜3次后用化學(xué)發(fā)光試劑（electrochemiluminescence，ECL）顯影曝光。Bax和BCL-2以GAPDH蛋白條帶作為參照，磷酸化的Akt以總Akt蛋白條帶作為參照，通過Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image Lab圖像軟件定量分析每個(gè)條帶灰度值。

1.3.5 心肌梗死面積計(jì)算 通過Evans和TTC雙重染色方法評估心肌損傷范圍。在心肌再灌注結(jié)束時(shí)，將0.2 mL 2%Evans藍(lán)染料注入下腔靜脈。當(dāng)心臟右側(cè)變藍(lán)時(shí)，迅速取出心臟，用0.9%氯化鈉溶液沖洗，并在-20℃冷凍。制備5個(gè)1 mm厚的心臟切片，并在1%TTC染料中37℃溫育20 min。TTC染成淡紅色的活組織被定義為危險(xiǎn)區(qū)（AAR）；伊文思藍(lán)染色的非缺血性心肌呈深藍(lán)色；梗死區(qū)（INF）在染色后顯蒼白色。評估同一切面各組小鼠心肌組織梗死面積大小。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用xˉ±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞內(nèi)miR-29b的表達(dá)水平在本研究中，我們通過qPCR檢測轉(zhuǎn)染不同類型小分子RNA后心肌細(xì)胞內(nèi)miR-29b的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示轉(zhuǎn)染miR-29b mimic后，miR-29b的表達(dá)水平（450.83±36.88）顯著增加，且較NC miRNA組（1.43±0.10）、正常對照組（1.29±0.20）明顯上調(diào)（均P＜0.05）。

2.2 miR-29b表達(dá)水平對心肌細(xì)胞活性的影響CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，100 μmol/L 和 200 μmol/L TBHP組能夠顯著抑制心肌細(xì)胞活性（P＜0.05）結(jié)果分別為（57±7）%，（52±4）%。給予 miR-29b mimic治療后心肌細(xì)胞存活率（85±3）%較NC miRNA（64±3）%及TBHP細(xì)胞模型組（65±3）%明顯上升（P＜0.05）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)miR-29b表達(dá)可以增加缺血再灌注損傷后心肌細(xì)胞的存活率。

2.3 上調(diào)miR-29b可降低心肌細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白表達(dá)蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果提示，與100 μmol/L TBHP處理組Bax/BCL-2的比值（4.37±0.37）相比，miR-29b mimic處理組心肌細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)水平明顯降低，BCL-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（見圖1A），Bax/BCL-2的比值（0.86±0.07）明顯的下調(diào)（P＜0.05，見圖1B）。NC miRNA處理組心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax/BCL-2的比值（4.26±0.41）較100 μmol/L TBHP處理組無明顯改變（P＞0.05，見圖1B）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-29b可以顯著降低心肌細(xì)胞凋亡水平，從而保護(hù)心肌細(xì)胞。

2.4 上調(diào)miR-29b表達(dá)可能通過Akt信號通路調(diào)控凋亡通過檢測各組心肌細(xì)胞中p-Akt、Akt蛋白表達(dá)水平明確miR-29b在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷中的具體調(diào)控機(jī)制。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果提示TBHP處理后心肌細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平（0.81±0.05）較正常對照組（0.22±0.01）明顯增高（P＜0.05）。上調(diào)miR-29b表達(dá)后，miR-29b mimic組Akt蛋白磷酸化水平（0.41±0.02）較TBHP處理組明顯降低（P＜0.05）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-29b可能通過下調(diào)Akt蛋白磷酸化水平，發(fā)揮缺血再灌注損傷時(shí)的心臟保護(hù)作用。見圖2。

圖1 miR-29b對于100 μmol/L叔丁基過氧化氫（TBHP）處理后心肌細(xì)胞凋亡蛋白Bax水平的影響：A為蛋白電泳圖；B為量化圖

圖2 miR-29b對于100 μmol/L叔丁基過氧化氫（TBHP）處理后心肌細(xì)胞Akt蛋白磷酸化水平的影響：A為蛋白電泳圖；B為量化圖

2.5 上調(diào)miR-29b表達(dá)可改善心肌梗死面積Evans藍(lán)和TTC雙重染色結(jié)果表明，I/R組小鼠（62±2）%和NC miRNA處理組小鼠心肌梗死范圍（60±4）%無明顯改變（P＞0.05），而給予miR-29b agomir處理（24±3）%后可有效減少缺血再灌注導(dǎo)致的心肌梗死范圍，增加心肌細(xì)胞存活率（P＜0.05）。見圖3。

2.6 上調(diào)miR-29b表達(dá)可減少心肌組織內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)我們在動物模型中再次驗(yàn)證miR-29b對于心肌組織凋亡的保護(hù)作用。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果提示，與I/R組小鼠Bax/BCL-2的比值（3.31±0.24）和NC miRNA處理組小鼠Bax/BCL-2的比值（3.24±0.32）相比，miR-29b agomir處理組小鼠心肌組織內(nèi)Bax蛋白表達(dá)明顯降低，BCL-2蛋白表達(dá)水平明顯升高，因此，miR-29b agomir處理組小鼠心肌組織內(nèi)Bax/BCL-2的蛋白比值（0.32±0.04）明顯下調(diào)（P＜0.05，見圖4），該結(jié)果表明上調(diào)miR-29b表達(dá)水平可以顯著降低缺血再灌注后心肌組織的凋亡水平。

3 討論

急性心肌梗死是心血管危重癥，病死率高，危害性大，隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，我們已能夠在心肌梗死發(fā)病的早期就對其進(jìn)行干預(yù)，臨床上的治療方法包括：藥物溶栓、支架介入和外科搭橋手術(shù)［9］。但是對于心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制尚未完全闡明，影響臨床上急性心肌梗死病人的預(yù)后。miRNA是一類參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控的小分子RNA，已被證明參與機(jī)體多種病理生理過程。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們通過轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)控心肌缺血再灌注細(xì)胞及動物模型中miR-29b表達(dá)水平，并進(jìn)一步檢測心肌細(xì)胞凋亡水平以及信號通路改變，明確miR-29b在心肌缺血再灌注損傷中的作用及其潛在機(jī)制。

圖4 miR-29b激動劑（agomir）治療對于心肌缺血再灌注損傷小鼠心肌組織凋亡蛋白表達(dá)水平的影響：A為蛋白電泳圖；B為量化圖

既往已有大量研究表明miR-29b在不同疾病中發(fā)揮重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-29b可以靶向作用于Sp1蛋白，然后通過抑癌基因PTEN/Akt信號通路抑制舌鱗狀細(xì)胞癌中癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲［10］。另有研究結(jié)果表明miR-29b通過靶向磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的高血壓大鼠腎纖維化過程［11］；Wu Y等［12］的研究表明 miR-1 和 miR-29b 可通過抑制PI3K/Akt信號通路，對心肌梗死后心室重構(gòu)產(chǎn)生不良影響。因此我們猜想miR-29b在心肌缺血再灌注中發(fā)揮重要作用，且Akt信號通路是其發(fā)揮作用的主要的信號通路。

在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-29b表達(dá)能夠有效減少心肌組織以及心肌細(xì)胞中凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)提高BCL-2蛋白的表達(dá)，這一結(jié)果表明miR-29b在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮抑制心肌細(xì)胞凋亡的作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，上調(diào)miR-29b表達(dá)能夠下調(diào)Akt蛋白磷酸化水平，因此我們推測miR-29b可能通過調(diào)控Akt信號通路改善心肌缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)的最大局限之處是沒有設(shè)立Akt信號通路激動劑處理組，因而尚不能說明一定是Akt信號通路在miR-29b抗凋亡中發(fā)揮作用。因此對于miR-29b通過Akt信號通路調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡這一結(jié)論還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究給予心肌缺血再灌注模型miR-29b處理，發(fā)現(xiàn)miR-29b組較I/R組的心肌細(xì)胞存活率、梗死面積均有明顯改善，心肌細(xì)胞凋亡水平降低，并且發(fā)現(xiàn)miR-29b能夠降低Akt的蛋白磷酸化水平，表明miR-29b可能通過該通路減少缺血再灌注時(shí)的心肌細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)心臟。

（本文圖3見插圖12-2）

圖3 miR-29b激動劑（agomir）治療改善心肌缺血再灌注造成的心肌組織損傷：A為染色圖（Evans藍(lán)和TTC雙重染色）；B為量化圖