選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L基因?qū)θ烁涡菭罴?xì)胞增殖及α平滑肌肌動蛋白、纖維酶原激活物抑制劑-1和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響

徐媛媛，聞廣華，張沖，楊雁

近年來，肝纖維化和肝癌已經(jīng)逐漸成為一種常見的且危害性極大的疾病。國內(nèi)外流行病學(xué)的相關(guān)研究報告均顯示，我國目前是肝癌病人數(shù)量最多的國家之一，2012年全球肝癌就新增78.25萬例，其中745 500例死亡，僅中國就占全球肝癌病例和死亡總數(shù)的50%左右，且肝癌的高發(fā)率和高病死率令廣大醫(yī)學(xué)研究者擔(dān)憂［1-2］。鑒于肝癌的難治愈性，針對早期肝纖維化的逆轉(zhuǎn)成為廣大學(xué)者的研究重點［3-5］。已有文獻(xiàn)報道，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是肝纖維化肝癌發(fā)生發(fā)展的主要調(diào)控因子［6］，Smad3是TGF-β1在細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵信號分子［7-8］。TGF-β1自肝星狀細(xì)胞分泌后，可進(jìn)一步地與細(xì)胞膜上的特異性受體產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)合，這種穩(wěn)定結(jié)合的結(jié)果是促使Smad3蛋白在胞內(nèi)的活化，活化后的Smad3蛋白可隨即與胞內(nèi)的Smad4蛋白進(jìn)一步結(jié)合形成易于轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)的蛋白分子共聚體，最終實現(xiàn)靶基因的激活、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［9］。臨床病例研究表明，在慢性乙型肝炎到肝纖維化、肝癌的發(fā)展過程中，肝臟中pSmad3L逐漸升高，而pSmad3C逐漸降低。且在成功的抗肝炎病毒治療后，肝細(xì)胞pSmad3C水平恢復(fù)正常，同時pSmad3L水平呈現(xiàn)降低趨勢［10］。大量研究均表明Smad3不同位點磷酸化在肝纖維化肝癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［11］，然而具體作用機制仍未闡明。

本研究于2017年3月至2018年5月采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的技術(shù)向人肝星狀細(xì)胞（LX-2）轉(zhuǎn)染野生型Smad3基因（Smad3 WT）、Smad3連接區(qū)磷酸化位點突變的基因（Smad3 EPSM）及Smad3 C末端磷酸化位點突變的基因（Smad3 3S-A）3種質(zhì)粒，實現(xiàn)選擇性上調(diào)LX-2細(xì)胞中pSmad 3C/3L基因的表達(dá)水平。以蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）驗證轉(zhuǎn)染效率，并檢測LX-2細(xì)胞中的α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖維酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）和Ⅰ型膠原蛋白（Collagen-Ⅰ）的表達(dá)水平。以四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MTT法）檢測選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L對LX-2細(xì)胞增殖能力的影響。觀察TGF-β1誘導(dǎo)的Smad3不同位點磷酸化對人肝纖維化細(xì)胞增殖和肝纖維化關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)一步探究pSmad 3C/3L在肝纖維化進(jìn)展中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺（北京冠鵬凈化設(shè)備有限責(zé)任公司）；Nap-co-6100型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國杜邦公司）；多功能酶標(biāo)儀（荷蘭雷勃公司）。DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司，20170213）；新生胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，19070503）；TGF-β1（Peprotech 公司，20161015）；FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑（Promega公司，20161121）；選擇培養(yǎng)基（Opti-MEM，20150507）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）（美國Sigma公司產(chǎn)品，20161207）；Western及IP細(xì)胞裂解液（20170530）、BCA蛋白濃度試劑盒（碧云天生物研究所20170918）；3種質(zhì)粒和pSmad3L抗體（日本關(guān)西醫(yī)科大學(xué)Matsuzaki博士惠贈）；Smad3（20170621）、Collagen-Ⅰ、PAI-1（20170309）和α-SMA抗體（Santa Cruz生物技術(shù)公司，20170415）；pSmad3C抗體（Cell Signaling Technology公司，20170110）

1.2 細(xì)胞株LX-2細(xì)胞株購于上海康朗生物科技有限公司。

1.3 選擇性上調(diào)pSmad3C/L的LX-2細(xì)胞系的建立

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與實驗分組 LX-2細(xì)胞于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%二氧化碳中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染和蛋白檢測實驗中，普通LX-2細(xì)胞和3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別設(shè)置對照組，TGF-β1刺激1 h組，TGF-β1刺激12 h組。細(xì)胞增殖實驗中，LX-2細(xì)胞和3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組分別設(shè)置對照組和TGF-β1刺激組。

1.3.2 Smad3 WT、Smad3 EPSM和Smad3 3S-A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞 將15%的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至95%融合的LX-2細(xì)胞接種到6孔板中，待24 h后，6孔板中細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，接近80%融合即可進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前棄去培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗2遍，配制轉(zhuǎn)染試劑100 μL選擇培養(yǎng)基（Opti-MEM）+2 μg（計算體積）質(zhì)粒/孔+6 μL/孔Fugene?HD（脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑），室溫孵15 min，加入FuGENE?HD時注意不要觸碰EP管壁，充分混勻。孵育時間到后貼壁加入6孔板中。對照組加入空質(zhì)粒和等體積的Opti-MEM+Fugene HD。所有加入無血清無雙抗的培養(yǎng)基放入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 h后，更換含血清的完全培養(yǎng)基。

1.4 MTT法檢測轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒對細(xì)胞增殖能力的影響轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒的LX-2細(xì)胞接種于96孔板中，種板密度為1×104/L，15%胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞密度接近90%時，饑餓過夜。除對照組外其余各孔分別加入9 pmol/L TGF-β1，而對照組添加等體積的無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)6～8 h。每組設(shè)置6個復(fù)孔。20 μL MTT加入到每孔中，37℃培養(yǎng)4 h。棄去各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，吹打，藍(lán)紫色充分溶解后，用酶標(biāo)儀測量各孔490 nm波長處吸光度值。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測LX-2細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒的LX-2細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基，PBS洗1遍，加無血清無雙抗的培養(yǎng)基，細(xì)胞饑餓12 h，隨后加入TGF-β1刺激1 h或12 h后，Western及IP細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒定量并調(diào)平蛋白樣本濃度并變性。用十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測目的蛋白表達(dá)水平，濕轉(zhuǎn)移法將凝膠上的條帶轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用剪刀剪個角標(biāo)記正反，封閉后依次進(jìn)行目的蛋白的特異性一抗二抗結(jié)合。最后使用Super Signal TM West Femto Trial Kit（賽默飛，中國）顯影。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法本研究采用SPSS 17.0軟件。統(tǒng)計結(jié)果表示為xˉ±s。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Smad3 WT、Smad3 EPSM和Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞的結(jié)果TGF-β1（9 pmol/L）刺激1 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與LX-2對照組比較，轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM和Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒的LX-2細(xì)胞中Smad3蛋白的表達(dá)均明顯增加［（0.48±0.02），（0.57±0.03），（0.60±0.02），（0.59±0.03）；P＜0.05］。與LX-2+Smad3 WT組相比，轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒的LX-2細(xì)胞中pSmad3C蛋白表達(dá)明顯增加［（0.33±0.02）比（0.44±0.01），P＜0.05］，轉(zhuǎn)染Smad3 S-A質(zhì)粒組pSmad3L蛋白表達(dá)明顯增加［（0.36±0.01）比（0.42±0.02），P＜0.05］。此結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒成功地選擇性上調(diào)了LX-2細(xì)胞中pSmad 3C/3L的表達(dá)。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染野生型Smad3基因（Smad3 WT）、Smad3連接區(qū)磷酸化位點突變的基因（Smad3 EPSM）及Smad3 C末端磷酸化位點突變的基因（Smad3 3S-A）3種質(zhì)粒后目的蛋白表達(dá)水平（n＝3）：A為蛋白質(zhì)印跡法電泳圖，B為無TGF-β1刺激時，目的蛋白表達(dá)柱狀圖，C為TGF-β1刺激后，目的蛋白表達(dá)柱狀圖

2.2 選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L對LX-2細(xì)胞增殖能力的影響MTT結(jié)果顯示，在無TGF-β1刺激情況下，轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM和Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒本身對LX-2細(xì)胞增殖能力無明顯影響［吸光度值（0.56±0.03），（0.59±0.09），（0.58±0.09），（0.59±0.04）；P＜0.05］。TGF-β1刺激6～8 h后，對LX-2組，Smad3 WT組、Smad3 3S-A組細(xì)胞增殖均有誘導(dǎo)作用，其中Smad3 3S-A質(zhì)粒組對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用更顯著［吸光度值（0.78±0.06），（0.77±0.08），（0.93±0.05）；P＜0.05］，提示：TGF-β1刺激可誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞的增殖反應(yīng)，選擇性高表達(dá)pSmad3L可進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng)。而轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒組則表現(xiàn)出細(xì)胞增殖反應(yīng)較無TGF-β1刺激組減弱［吸光度值（0.58±0.09）比（0.48±0.03），P＜0.05］，提示：TGF-β1刺激后，選擇性高表達(dá)pSmad3C可抑制細(xì)胞增殖反應(yīng)。見圖2。

圖2 選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L對LX-2細(xì)胞增殖能力的影響（n＝6）

2.3 選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L對LX-2細(xì)胞中α-SMA、PAI-1和Collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)水平的影響TGF-β1（9 pmol/L）刺激12 h后，提取各組細(xì)胞總蛋白，蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與對照組比較，α-SMA蛋白在Smad3 WT組略有增加，在Smad3 EPSM組明顯降低，而在Smad3 S-A組表達(dá)明顯增加［（0.66±0.04），（0.71±0.01），（0.50±0.004），（0.82±0.002）；P＜0.05］。與對照組比較，PAI-1蛋白在Smad3 WT質(zhì)粒組無明顯變化，在轉(zhuǎn)染Smad3 EPSM質(zhì)粒的LX-2細(xì)胞中表達(dá)明顯減少，而在轉(zhuǎn)染Smad3 S-A質(zhì)粒組表達(dá)則明顯增加［（0.30±0.006），（0.32±0.009），（0.20±0.004），（0.34±0.006）；P＜0.05］。Collagen-Ⅰ蛋白變化趨勢與PAI-1相同［（0.27±0.002），（0.32±0.01），（0.24±0.003），（0.35±0.004）；P＜0.05］。此結(jié)果提示，選擇性上調(diào)pSmad3C，可以抑制LX-2細(xì)胞中α-SMA、PAI-1和Collagen-Ⅰ的表達(dá)；而選擇性上調(diào)pSmad3L則可促進(jìn)α-SMA、PAI-1和Collagen-Ⅰ的表達(dá)。見圖3。

3 討論

研究表明，肝纖維化的主要病理機制在于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的沉積，而肝星狀細(xì)胞是分泌ECM的主要細(xì)胞，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［12］。Collagen-Ⅰ是ECM的主要成分，其含量的高低在一定程度上反應(yīng)了肝纖維化的嚴(yán)重程度。抑制肝星狀細(xì)胞的增殖，減少Collagen-Ⅰ的產(chǎn)生可以減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化［13］。α-SMA被普遍認(rèn)為是肝星狀細(xì)胞活化的標(biāo)志性蛋白，有研究表明α-SMA含量的高低與肝星狀細(xì)胞的增殖和肝纖維化的程度密切相關(guān)［12］。課題組前期研究表明，二乙基亞硝胺（DEN）誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化-肝癌進(jìn)展過程中，pS-mad3L和PAI-1蛋白的表達(dá)水平逐漸增加，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方丹參提取物和丹酚酸B均可通過調(diào)控TGF-β/Smad3信號通路的活化發(fā)揮抗肝纖維化-肝癌的作用，具體可能涉及到對Smad3不同位點磷酸化的水平的調(diào)控［14-15］。本研究通過轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM、Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒，選擇性上調(diào)LX-2細(xì)胞中pSmad 3C/3L的表達(dá)，并進(jìn)一步探討選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L對LX-2細(xì)胞增殖功能的影響，及肝纖維化關(guān)鍵蛋白α-SMA、PAI-1和Collagen-Ⅰ表達(dá)的影響。

圖3 選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L對LX-2細(xì)胞中α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖維酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）和Ⅰ型膠原蛋白（Collagen-Ⅰ）表達(dá)水平的影響（n＝3）：A為蛋白質(zhì)印跡法電泳圖，B、C、D分別為α-SMA、PAI-1和Collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)柱狀圖

瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是目前常用的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，瞬時轉(zhuǎn)染方法由于其具有快速方便，轉(zhuǎn)染周期較短，轉(zhuǎn)染效率高等特點，目前在基礎(chǔ)研究中使用越來越廣泛［12-13］。瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)可以在短時間內(nèi)將攜帶特定外源基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，利用同源重組的原理整合到細(xì)胞染色體DNA上，實現(xiàn)進(jìn)一步的表達(dá)［16-17］。本研究采用性能更優(yōu)的FuGENE?HD脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑向LX-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染Smad3 WT、Smad3 EPSM及 Smad3 3S-A 3種質(zhì)粒，選擇性上調(diào)LX-2細(xì)胞中pSmad 3C/3L的表達(dá)水平，在細(xì)胞水平研究Smad3不同位點磷酸化在肝纖維化進(jìn)展中的重要作用，進(jìn)一步揭示肝病的臨床病例研究中pSmad 3C/3L在肝臟中差異表達(dá)的內(nèi)在分子機制［11］，同時在一定程度上為本課題組后續(xù)構(gòu)建的Smad3 C末端磷酸化位點突變的整體動物水平的研究提供了理論支撐。

肝星狀細(xì)胞的過度增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究中，TGF-β1刺激后，選擇性高表達(dá)pSmad3L可進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng)，而選擇性高表達(dá)pSmad3C可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng)。進(jìn)一步的結(jié)果表明選擇性上調(diào)pSmad3C，可以明顯抑制LX-2細(xì)胞中PAI-1、Collagen-Ⅰ和α-SMA的表達(dá)；而選擇性上調(diào)pSmad3L則可促進(jìn)α-SMA、PAI-1和Collagen-Ⅰ的表達(dá)。上述結(jié)果提示，選擇性上調(diào)pSmad 3C/3L表達(dá)可調(diào)控肝星狀細(xì)胞的增殖和肝纖維化關(guān)鍵蛋白α-SMA、PAI-1和Collagen-Ⅰ表達(dá)，為肝纖維化的治療提供新的思路。