基于Fe3O4過氧化物酶活性的Cd2+和Pb2+比色傳感器

楊文平,吳遠(yuǎn)根

1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽 550025;2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院,北京 100083

隨著工業(yè)的高速發(fā)展，重金屬污染越來越嚴(yán)重。環(huán)境中的重金屬半衰期較長，難降解，易通過各種渠道進(jìn)入食物鏈，富集在生物體內(nèi)，引發(fā)多種疾病。例如，鎘能引起腎小管功能障礙、中毒性腎損害和癌癥等疾病[1-5]。鉛可導(dǎo)致智力發(fā)育遲緩，尤其影響兒童大腦的發(fā)育[6-7]。鑒于其危害嚴(yán)重性，世界衛(wèi)生組織、美國EPA和我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部均對環(huán)境和飲用水中的鎘和鉛重金屬離子含量制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。目前，一些分析技術(shù)已普遍用于鎘和鉛的含量分析，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法[8-10]、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法[11]、原子吸收/發(fā)射光譜法[12]、原子熒光光譜法[13]、反相高效液相色譜法[14]和電化學(xué)分析法[15]等。這些方法精確度和準(zhǔn)確度較高，但一般需昂貴的檢測儀器、專業(yè)的操作人員、復(fù)雜的樣品前處理流程、高昂的檢測成本以及較長的檢測時間，不適合于發(fā)展中國家或偏遠(yuǎn)地區(qū)鎘和鉛重金屬含量的實(shí)時在線監(jiān)測。因此，為滿足實(shí)際需要，亟需開發(fā)快速、簡單和高效的鎘和鉛重金屬離子檢測方法。

近年來，許多新的快速檢測方法已經(jīng)建立，包括酶分析法、免疫分析法、試紙條法以及生物傳感器法[16-20]。這些方法快速、簡單、檢測成本低，非常適合于偏遠(yuǎn)地區(qū)的鎘和鉛重金屬離子的實(shí)時快速監(jiān)測。但是，它們?nèi)匀淮嬖谝欢ǖ牟蛔?，例如：酶分析法所需的酶穩(wěn)定性不高、易失活；免疫分析法需專門的抗原抗體且修飾過程相對復(fù)雜；試紙條法定量困難；電化學(xué)或熒光傳感器法需專門的儀器。因此許多研究者將目光集中于比色傳感器，其檢測過程簡單、檢測結(jié)果肉眼可辨，但遺憾的是，基于納米材料聚集顯色的比色傳感器易受非特異性靶標(biāo)的干擾。因此，仍非常有必要借助其他技術(shù)彌補(bǔ)比色傳感器的缺陷。

納米酶是一類具有模擬酶特性的納米材料[21]，可催化底物氧化產(chǎn)生各種顏色變化。同時，納米酶巨大的比表面積又非常有利于其表面的功能化。例如：Fe3O4具有過氧化物酶活性，可催化過氧化物酶底物氧化顯色[22]。目前，基于Fe3O4催化活性建立的分析方法已成功應(yīng)用于環(huán)境[23-25]、醫(yī)學(xué)[26-28]和食品安全[29-30]等各個領(lǐng)域。在重金屬檢測方面，之前的研究大多集中于利用Fe3O4的吸附性能聯(lián)合其他檢測方法對重金屬進(jìn)行檢測[31-32]，而基于Fe3O4納米酶直接催化的比色傳感器較少。另外，核酸適配體是通過指數(shù)富集的配體進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選獲得的對特定化學(xué)或生物靶物質(zhì)具有高親和力的DNA或RNA片段。其合成簡單、易于修飾和具有靶向識別功能，已廣泛應(yīng)用于小分子、蛋白和細(xì)胞等各種物質(zhì)的識別[33]。因此，本文聯(lián)合具有催化活性的Fe3O4和具有一定特異性識別功能的核酸序列，建立了一種重金屬比色檢測方法。其中，檢測體系的顏色與鎘和鉛濃度直接相關(guān)，可通過溶液顏色的變化或氧化產(chǎn)物特征吸收峰的強(qiáng)弱實(shí)現(xiàn)鎘和鉛離子濃度分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 G4(序列:5′-GGGTGGGTGGGTGGGT-3′)由上海生工生物工程股份有限公司合成。六水氯化鐵、乙二醇、尿素、聚乙二醇、4-氨基替比林及所有重金屬標(biāo)準(zhǔn)品購自阿拉丁股份有限公司，其他試劑均為市售分析純試劑。96-孔板購于康寧公司(Corning Incorporated)。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.1.2主要儀器 用全波長讀數(shù)儀(Thermo Scientific Multiskan GO Microplate Spectrophotomer,USA)測量樣品的紫外/可見吸收光譜和吸光值；通過掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察磁珠的電子顯微圖像并測量其大小；用傅氏轉(zhuǎn)換紅外線光譜分析儀(FT-IR)獲得紅外光譜圖；樣品超聲處理1 h后，用納米粒徑和zeta電位儀(Nano Particle &Zeta Potential Analyzer,USA)測量納米粒的zeta電位。

1.2 方法

1.2.1檢測原理 本文主要基于Fe3O4模擬酶催化活性及核酸的識別功能，建立了一種Cd2+和Pb2+比色檢測法。Fe3O4具有過氧化物酶活性，可催化顯色底物氧化產(chǎn)生顏色變化。如圖1所示，當(dāng)沒有靶標(biāo)離子存在時，核酸序列吸附于納米粒表面，F(xiàn)e3O4納米酶對過氧化物酶底物催化活性較低，520 nm處產(chǎn)物特征吸收峰值較低。而當(dāng)溶液中含有靶標(biāo)重金屬離子時，核酸序列可與Cd2+和Pb2+離子形成螯合籠結(jié)構(gòu)[34-35]，此復(fù)合物可增加納米酶與底物之間的親和力，同時核酸從Fe3O4上剝離下來，進(jìn)一步促進(jìn)Fe3O4氧化底物AAP產(chǎn)生肉眼可見的紅色，產(chǎn)物特征吸收峰值較高。其中眾多金屬離子中，由于G4核酸序列與Cd2+和Pb2+離子的親和力最強(qiáng)[36]，所以在檢測過程中僅含Cd2+和Pb2+離子的樣品能顯著增強(qiáng)Fe3O4的催化活性。因此，可以通過反應(yīng)溶液顏色的變化和AAP產(chǎn)物特征吸收峰值的變化判斷重金屬是否超標(biāo)。

圖1 基于Fe3O4過氧化物酶催化活性檢測Cd2+和Pb2+重金屬離子原理圖Fig.1 Schematic illustration of the developed colorimetric sensors for Cd2+ and Pb2+ detection based on the peroxidase activity of Fe3O4

1.2.2磁珠的制備 參照文獻(xiàn)[37]采用水熱反應(yīng)法制備磁珠。制備過程如下：稱取1.15 g六水氯化鐵溶于30 mL乙二醇中，混勻得到橘黃色液體。將2.0 g尿素和2.0 g聚乙二醇加至上述溶液中，磁力攪拌30 min形成均勻溶液。取28.8 mL上述溶液于反應(yīng)釜中(約占反應(yīng)釜容積80%)，密封好于200 ℃下保溫20 h。反應(yīng)完畢，待反應(yīng)釜冷卻至室溫，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至燒杯中，用蒸餾水和乙醇反復(fù)清洗，60 ℃干燥3 h得到黑色粉末。

1.2.3實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化 本文以1 μmol/L靶標(biāo)離子濃度為基準(zhǔn)，分別考察緩沖溶液、緩沖溶液pH、底物、磁珠和核酸的濃度、反應(yīng)時間等參數(shù)。最終，通過體系溶液520 nm波長處傳感信號的強(qiáng)弱確定重金屬檢測的最優(yōu)參數(shù)。

1.2.4性能測定 取5 μL 1 μmol/L G4和2 μL 靶標(biāo)離子標(biāo)準(zhǔn)液于1.5 mL離心管中，空白對照加入等量二蒸水代替標(biāo)準(zhǔn)液，30 ℃孵育50 min。然后加入5 μL 3 mg/mL Fe3O4溶液，混勻后再孵育50 min。反應(yīng)完畢，加入一定量的過氧化物酶底物(50 μL 500 mmol/L AAP和10 μL 0.5 mol/L H2O2)和428 μL 3.5 mmol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH 4.0)。取200 μL上述溶液進(jìn)行紫外-可見吸光值測定。檢測信號為ΔA520，其中ΔA=A(Cd2+)-A(空白)。特異性實(shí)驗(yàn)則通過向體系中添加等量(1 μmol/L)的競爭性重金屬離子(Zn2+、Fe2+、Hg2+、Ag+、As3+、Al3+、Cu2+和Cr3+)測試此法特異性能。

2 結(jié)果與分析

2.1 可行性分析

如圖2，單獨(dú)的Fe3O4溶液在520 nm波長處無吸收峰(圖2樣1)，僅含底物的反應(yīng)體系520 nm波長處吸收峰較弱 (A為0.105)(圖2樣2),說明H2O2可誘導(dǎo)底物AAP發(fā)生輕微氧化。加入一定量Fe3O4納米酶后，反應(yīng)體系在520 nm波長處的吸光值迅速增加至0.223(圖2樣3)，說明在含H2O2的條件下Fe3O4可催化底物AAP氧化成產(chǎn)物，且于520 nm波長處為產(chǎn)物特征吸收峰。當(dāng)向體系中加入G4核酸時，反應(yīng)體系520 nm波長處的吸光值有一定程度的下降(A為0.217),可能是由于核酸可以吸附在Fe3O4上，核酸的包封使納米粒子與底物的接觸受到了影響，從而降低其酶的催化活性。然而當(dāng)有靶標(biāo)Cd2+和Pb2+存在時，其520 nm波長處的吸收峰明顯增加，說明Cd2+和Pb2+離子可與Fe3O4競爭性結(jié)合G4核酸，使核酸從Fe3O4剝離下來，或者形成的復(fù)合物能誘導(dǎo)Fe3O4的催化活性，增強(qiáng)其對底物AAP的氧化能力。

2.2 Fe3O4納米粒子的表征

本文制備的磁性Fe3O4納米粒子，SEM表征結(jié)果說明其形狀為球形，粒徑大小約20 nm(圖3A)。FT-IR能譜表征結(jié)果如圖3B，602 cm-1處的強(qiáng)吸收峰與Fe-O鍵相關(guān)，1 628 cm-1處的吸收峰為N-H剪式振動，1 090 cm-1和892 cm-1處的吸收峰為胺的N-H搖擺振動。

樣1—Fe3O4溶液；樣2—H2O2 + TMB；樣3—Fe3O4 + H2O2 + TMB；樣4—G4 + Fe3O4 + H2O2 + TMB；樣5—Pb2+ + G4 + Fe3O4 + H2O2 + TMB；樣6—Cd2+ + G4 + Fe3O4 + H2O2 + AAP。圖2 基于Fe3O4過氧化物酶催化活性檢測Cd2+和Pb2+重金屬離子的可行性分析Fig.2 Feasibility verification of the developed colorimetric sensors for Cd2+ and Pb2+ detection based on the peroxidase activity of Fe3O4

2.3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1緩沖溶液pH及濃度 Fe3O4模擬酶催化活性與反應(yīng)介質(zhì)密切相關(guān)，如圖4A，pH較低時，隨pH增加(3.0～3.5)檢測信號增強(qiáng)；當(dāng)pH升至3.5～4.0時檢測信號達(dá)到最強(qiáng)；當(dāng)pH繼續(xù)增加時(4.0～5.0)，檢測信號不再增強(qiáng)反而減弱。其原因可能是，磁珠的催化活性及其與底物之間的反應(yīng)與反應(yīng)體系中的電子密度密切相關(guān)。因此，后續(xù)以pH 3.5的緩沖溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

緩沖液濃度對重金屬離子檢測的影響如圖4B，緩沖液濃度為1～3.5 mmol/L時，隨著緩沖液濃度增加傳感信號增強(qiáng)；當(dāng)緩沖液濃度達(dá)到3.5～8.0 mmol/L時，傳感信號達(dá)到最大；若繼續(xù)升高緩沖液濃度，檢測信號則減弱。結(jié)果表明，緩沖液濃度為3.5～8.0 mmol/L的反應(yīng)體系更適合于本法對靶標(biāo)離子的檢測。因此，選擇3.5 mmol/L NaAc-HAc 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2底物濃度 本文考察了不同濃度AAP和H2O2對檢測信號的影響，如圖5A所示。當(dāng)?shù)孜顰AP濃度很低時，檢測信號較弱。隨著底物濃度從1 mmol/L逐漸增加至50 mmol/L，檢測信號變強(qiáng)。當(dāng)再進(jìn)一步增加底物濃度時，信號不再增強(qiáng)反而減小。

A：SEM電鏡圖；B：FT-IR能譜表征圖圖3 Fe3O4的SEM電鏡和FT-IR能譜表征圖Fig.3 SEM image and FT-IR spectrum of Fe3O4

A:緩沖溶液pH的優(yōu)化;B:NaAc-HAc濃度的優(yōu)化圖4 緩沖溶液pH及濃度的優(yōu)化Fig.4 The optimization of pH and concentration of buffer solution

A:底物AAP濃度的優(yōu)化;B:H2O2濃度的優(yōu)化圖5 反應(yīng)體系中底物AAP和H2O2濃度的優(yōu)化Fig.5 The optimization of AAP and H2O2 concentration in reaction system

對于H2O2，當(dāng)其濃度為1 mmol/L時檢測信號不明顯(圖5B)。隨著H2O2濃度從1 mmol/L增加至10 mmol/L，檢測信號顯著增強(qiáng)并達(dá)到最大。而當(dāng)H2O2濃度進(jìn)一步增加時(10～40 mmol/L)，檢測信號基本穩(wěn)定，不再隨著H2O2濃度的增加而發(fā)生變化。說明H2O2可以促進(jìn)納米酶催化底物，直至酶與底物之間的反應(yīng)達(dá)到飽和。因此，后續(xù)選擇10 mmol/L H2O2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3.3磁珠濃度 通過對反應(yīng)體系中磁珠濃度進(jìn)行優(yōu)化，其結(jié)果如圖6所示。在5～30 μg/mL Fe3O4濃度范圍內(nèi)，隨磁珠濃度增加檢測信號增強(qiáng)，且于30 μg/mL時Cd2+的檢測信號達(dá)到最大值，而Pb2+的檢測信號在30～60 μg/mL Fe3O4范圍內(nèi)出現(xiàn)最大值。之后，隨Fe3O4濃度增加檢測信號不再增強(qiáng)反而下降。可能的原因是，當(dāng)納米酶催化還未達(dá)到飽和時，增加酶的濃度有助于檢測信號增強(qiáng)。而當(dāng)酶與底物反應(yīng)達(dá)到飽和之后，再增加酶的濃度可能會增加檢測背景信號，造成檢測信號降低。所以，以30 μg/mL Fe3O4作為最優(yōu)濃度。

2.3.4核酸濃度 核酸適配體能與特定靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合，因此在檢測過程中使用適配體對檢測特異性的增強(qiáng)非常重要。Liu等[36]曾對各種重金屬離子適配體進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)G4與Cd2+和Pb2+的結(jié)合能力相對較強(qiáng)，所以本實(shí)驗(yàn)使用G4序列作為靶標(biāo)識別元件。體系中核酸濃度的優(yōu)化結(jié)果如圖7所示，當(dāng)G4濃度為10～20 nmol/L時，體系檢測信號很強(qiáng)；但隨著體系中核酸濃度的增加(從20～50 nmol/L)，檢測信號逐漸下降。下降的原因可能是，過多的核酸濃度緊緊包裹在磁珠表面，導(dǎo)致了其催化活性不易受靶標(biāo)的調(diào)控。此外，隨核酸濃度加大，Cd2+的檢測信號比Pb2+的下降得更多。這可能是因?yàn)椋粋€Cd2+只能與一個G4結(jié)合，而一個Pb2+卻能與多個G4結(jié)合，導(dǎo)致等量的靶標(biāo)對G4的結(jié)合量不等，所以核酸濃度對體系信號的影響情況不一致。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以10 nmol/L的核酸作為最優(yōu)濃度。

圖6 反應(yīng)體系中Fe3O4濃度的優(yōu)化Fig.6 The optimization of Fe3O4 concentration in reaction system

圖7 反應(yīng)體系中G4核酸濃度的優(yōu)化Fig.7 The optimization of G4 concentration in reaction system

2.3.5孵育時間 如圖8所示，在10～50 min內(nèi)，檢測信號隨孵育時間的增加而逐漸增加直至50 min。當(dāng)孵育時間超過50 min之后，體系檢測信號達(dá)到平穩(wěn)，不再隨著孵育時間的增加而增加。因此，后續(xù)以50 min作為孵育時間。此外，Cd2+的檢測信號與Pb2+的類似，但其檢測信號始終比Pb2+強(qiáng)。

圖8 孵育時間的優(yōu)化Fig.8 The optimization of incubation time

2.4 靈敏度實(shí)驗(yàn)

分別往體系中加入不同濃度Cd2+(0.1～60 μmol/L)和Pb2+(0.1～60 μmol/L)離子，記錄400～800 nm的吸收光譜，計算其520 nm處的吸光差值ΔA520。如圖9A所示，隨著Cd2+濃度增加，體系520 nm處吸收峰逐漸升高，檢測信號ΔA520逐漸增強(qiáng)，當(dāng)Cd2+濃度超過60 μmol/L后，其檢測信號逐漸趨于平緩(圖9C)。在低濃度(0.1～0.9 μmol/L)條件下，本方法檢測信號ΔA520與體系中Cd2+濃度呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.008+0.236x，其相關(guān)系數(shù)為0.9985。根據(jù)3σ/slope計算，得到本方法對Cd2+的最低檢測限LOD=0.108 μmol/L。

同樣的，按上述方法對Pb2+靈敏度進(jìn)行測試。與Cd2+類似，隨著溶液中Pb2+濃度增加，體系在520 nm處的吸收峰逐漸升高(圖9B)，其檢測信號ΔA520也逐漸增強(qiáng)，當(dāng)Pb2+濃度超過40 μmol/L后，其檢測信號逐漸趨于平緩(圖9D)。在低濃度(0.1～1 μmol/L)條件下，本方法檢測信號ΔA520與體系中Pb2+濃度呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.0092+0.2181x，其相關(guān)系數(shù)為0.9972。根據(jù)3σ/slope計算，得到本方法對Pb2+的最低檢測限LOD=0.117 μmol/L。

2.5 特異性實(shí)驗(yàn)

為研究本傳感體系對Cd2+和Pb2+重金屬離子的檢測特異性，分別向體系中加入等量(1 μmol/L)的競爭性離子(Zn2+、Fe2+、Hg2+、Ag+、As3+、Al3+、Cu2+和Cr3+)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測量其吸收光譜，計算檢測信號ΔA520，結(jié)果如圖10所示。含Cd2+和Pb2+的反應(yīng)體系溶液為紅色，而不含任何靶標(biāo)的空白組和含其他競爭性離子的試驗(yàn)組體系溶液基本為淺黃色(圖10)。因此,僅僅通過溶液顏色即可初步判斷樣品中Cd2+和Pb2+是否超標(biāo)。此外，通過測定其520 nm處的吸光信號ΔA，發(fā)現(xiàn)含Cd2+和Pb2+的試驗(yàn)組其檢測信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他的競爭性靶標(biāo)。因此，通過測定其520 nm處的吸光信號ΔA也可判斷Cd2+和Pb2+離子是否超標(biāo)。

3 討論

本研究基于磁性Fe3O4納米酶催化活性建立了一種Cd2+和Pb2+重金屬離子比色檢測法。當(dāng)Cd2+和Pb2+存在時，體系溶液為紅色；當(dāng)沒有Cd2+和Pb2+存在時，體系溶液為淺黃色或趨于無色。最優(yōu)檢測條件為：3.5 mmol/L NaAc-HAc緩沖溶液(pH 3.5)、50 mmol/L AAP、10 mmol/L H2O2、30 μg/mL Fe3O4、10 nmol/L G4和 50 min的孵育時間。當(dāng)Cd2+和Pb2+濃度在0.1～0.9 μmol/L和0.1～1 μmol/L時，其最低檢測限分別為0.108 μmol/L、0.117 μmol/L。本方法受競爭性離子(Zn2+、Fe2+、Hg2+、Ag+、As3+、Al3+、Cu2+和Cr3+)的干擾較小，特異性較強(qiáng)。

A，B：分別為傳感器對不同Cd2+和Pb2+濃度的吸收光譜圖；C，D：分別為對應(yīng)的傳感信號值曲線圖(插圖為線性關(guān)系圖)。圖9 基于磁性Fe3O4納米酶催化活性的Cd2+和Pb2+重金屬離子靈敏度檢測Fig.9 Sensitivity of the present colorimetric sensors for Cd2+ and Pb2+ detection based on the peroxidase activity of Fe3O4

圖10 基于磁性Fe3O4納米酶催化活性的Cd2+和Pb2+重金屬離子特異性檢測Fig.10 Specificity of the present colorimetric sensors for Cd2+ and Pb2+ detection based on the peroxidase activity of Fe3O4

總之，本文建立的Cd2+和Pb2+重金屬離子比色檢測法具有一定的優(yōu)點(diǎn)，如無需昂貴檢測儀器和復(fù)雜操作過程、檢測成本低等，因此更適合于發(fā)展中國家或偏遠(yuǎn)地區(qū)的實(shí)時在線監(jiān)測。但本方法還存在一定的不足，雖核酸或適配體序列能一定程度提高特異性檢測，但實(shí)際樣品中往往存在著多種未知的陰陽離子和有機(jī)物，如何進(jìn)一步提升本方法或該類方法的特異性依然有待研究。