加味五虎追風(fēng)散對魚藤酮誘導(dǎo)的帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元α-syn及TH表達的影響

陳 煒，梁健芬，蔣凌飛，吳 林，張興博

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是中老年人致殘的主要原因之一，全球患病率為100/10萬～200/10萬[1]，隨著我國人口老齡化的發(fā)展，PD成為中老年人致殘的主要原因之一。本病目前尚無特效藥物，被公認為治療PD“金藥物”的左旋多巴也只能在一定程度上緩解癥狀，不能阻止黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元逐步走向死亡的結(jié)局，難以從根本上改變疾病加重的態(tài)勢，并且長期使用療效遞減，臨床出現(xiàn)癥狀波動和異動癥等運動并發(fā)癥也十分常見。因此，本課題組用魚藤酮誘導(dǎo)帕金森病模型大鼠，觀察加味五虎追風(fēng)散對黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-syn)及酪氨酸羥化酶(TH)蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 90只SPF級Wistar大鼠，體重(200±50)g，雌雄各半，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。將所有大鼠隨機分為空白對照組(空白組)、PD模型對照組(模型組)、中藥加味五虎追風(fēng)散低劑量組(中藥低劑量組)、中藥加味五虎追風(fēng)散中劑量組(中藥中劑量組)、中藥加味五虎追風(fēng)散高劑量組(中藥高劑量組)，每組16只。

1.2 實驗藥物 加味五虎追風(fēng)散(蟬蛻6 g，天南星6 g，天麻12 g，全蝎3 g，僵蠶10 g，大地棕根15 g)，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房購于江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司，為新型濃縮顆粒劑。

1.3 實驗試劑 魚藤酮(美國Sigma公司)，葵花乳油(美國Sigma公司)，α-syn 抗體(北京博奧森生物有限公司)，TH抗體(北京碧云天生物有限公司)。

1.4 動物造模 采用頸、背部交替皮下注射魚藤酮法制備模型。將魚藤酮溶于葵花油乳油中，濃度為2 mg/mL，劑量為每日2 mg/kg，頸背部皮下注射，每天注射1次，連續(xù)注射28 d。經(jīng)行為學(xué)測試大鼠出現(xiàn)震顫、僵直、運動遲緩、步態(tài)不穩(wěn)即為造模成功[2-3]。密切觀察造模中及造模后大鼠情況，造模大鼠死亡0只，空白組死亡2只。

1.5 行為學(xué)檢測 按陳忻等[4]的帕金森病動物模型行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進行行為學(xué)檢測，將大鼠行為變化分為6個等級計分：1分，大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱、豎毛、毛色變黃變臟、弓背、主動活動減少；2分，有1分的表現(xiàn)，且主動活動減少明顯、動作遲緩，并有震顫或步態(tài)不穩(wěn)；4分，有2分的表現(xiàn)，且步態(tài)不穩(wěn)，或不能直線行走或步行時間向一側(cè)旋轉(zhuǎn)；6分，向單向斜臥，單側(cè)前肢和/或后肢癱瘓，行走困難、進食困難；8分，單側(cè)，前肢和/或后肢完全癱瘓，四肢拘攣，體重大幅度減輕，不能進食；10分，瀕臨死亡或死亡。本實驗將2～6分大鼠入選PD模型，最后經(jīng)行為學(xué)篩選剔除造模大鼠1只，故符合PD模型要求大鼠共有80只，空白組為14只，模型組15只，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組各16只，將剩下的大鼠進行后續(xù)實驗。

1.6 灌胃給藥 待造模后靜養(yǎng)1周開始對大鼠進行灌胃給藥，每天2次，間隔12 h，連續(xù)灌胃28 d，藥量的確定按人與大鼠體表面積系數(shù)計算，中劑量與臨床中人的用藥等效劑量相對應(yīng)，中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組分別給予加味五虎追風(fēng)散4.15 g/(kg·d)、8.3 g/(kg·d)、16.9 g/(kg·d)灌胃，模型組及空白組用相等體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)28 d。

1.7 取材 實驗結(jié)束后，大鼠用水合氯酸腹腔注射麻醉后，立即取腦，迅速分離出中腦黑質(zhì)及紋狀體。其中一半放入備好的多聚甲醛的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中，固定1周以上，再移入到含蔗糖的溶液中，待腦組織下沉后用冰凍切片機切取厚的冠狀切片，行免疫熒光染色。另外一半迅速分離之后放入-80 ℃冰箱，低溫保存[5]。

1.8 Western-Blot檢測大鼠腦組織 取材后將黑質(zhì)組織按照1∶10(質(zhì)量∶體積)比例加入裂解液，冰上超聲處理10 s后，沸水浴中5 min 變性，15 000 r/min離心15 min，吸取上清，每管20 μL分裝，-70 ℃保存。核蛋白的提取應(yīng)用凱基核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒，操作步驟均參照說明書。取10 μL樣品，泳道上樣于12% SDS-PAGE 進行凝膠電泳，4 ℃ 300 mA 電轉(zhuǎn)90 min。5% BSA-TBST 封閉1 h后，加入相應(yīng)蛋白抗體，4 ℃過夜。TBST 緩沖液漂洗10 min×3次后，加入二抗，室溫孵育1 h后加入ECL(Pierce)發(fā)光底物顯色?；瘜W(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)顯影分析。用目的蛋白灰度值與胞漿蛋白內(nèi)參β-actin 灰度值之比進行半定量分析。比較各組黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-syn聚集情況及TH蛋白含量。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)結(jié)果 造模的大鼠在皮下注射魚藤酮葵花油乳液后第3天就出現(xiàn)了捕捉動作減少的現(xiàn)象，并逐漸出現(xiàn)活動減少、動作遲緩等帕金森病癥候群特征。注射第1周后大鼠的理毛能力下降，毛色開始發(fā)黃、變臟，出現(xiàn)有豎毛現(xiàn)象。有部分大鼠出現(xiàn)口鼻出血，有的大鼠由于活動減少，肢體不靈活而進食減少，模型組有1只大鼠出現(xiàn)偏癱，不能進食，評分為10分，所以剔除實驗。有文獻提示，注射第1周時動物死亡率最高，但本實驗所有造模大鼠均未出現(xiàn)死亡。空白組最終均存活14只，中藥中劑量組、中藥高劑量組各存活16只。

2.2 大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn、TH蛋白含量變化 造模后，模型組腦黑質(zhì)區(qū)α-syn含量增加，與空白組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組腦黑質(zhì)區(qū)α-syn含量較模型組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其中中藥高劑量組腦黑質(zhì)區(qū)α-syn含量均低于中藥中劑量組、中藥低劑量組(P<0.05)。與空白組比較，模型組TH蛋白含量明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組TH蛋白表達升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，其中中藥高劑量組TH蛋白表達均高于中藥中劑量組、中藥低劑量組(P<0.05)。詳見表1、圖1。

表1 各組大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn、TH蛋白含量比較(±s)

與空白組比較，1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較，3)P<0.05，4)P<0.01；與中藥低劑量組、中藥中劑量組比較，5)P<0.05

A：空白組；B：模型組；C：中藥低劑量組；D：中藥中劑量組；E：中藥高劑量組

3 討 論

PD是以肢體震顫、肌強直、隨意運動障礙為主要臨床特征，中醫(yī)屬“顫證”“痙證”范疇?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩唬骸爸T暴強直，皆屬于風(fēng)，諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝。”指出了肝風(fēng)內(nèi)動的基本病機。若腎陰精虧，無力上承以養(yǎng)腦，骨髓不充，行則振掉，精氣不足則化血乏源，血不足則無以濡養(yǎng)筋脈，易生風(fēng)致顫然。《赤水玄珠全集·顫振門》中認為顫證的病機是“腎陰不充，下虛上實，實為痰火，虛則腎虧”。因此本病病位主要在腦，著于筋脈，關(guān)乎五臟，證屬本虛標(biāo)實，腎虛為本病發(fā)病之根本，又涉及肝、脾等臟腑；標(biāo)實為“內(nèi)風(fēng)”“瘀血”“痰濁”而致心神失主，經(jīng)脈肢體失控。可見痰瘀交阻生風(fēng)是PD的重要病機，且在PD 的發(fā)病過程中痰、瘀、風(fēng)貫穿了疾病的全過程[6]。因此，認為原方五虎追風(fēng)散祛瘀化痰熄風(fēng)作用明顯，雖重治其標(biāo)，但對其發(fā)病之本不能兼顧，基于對PD的中醫(yī)病機認識，主張古方新用，在五虎追風(fēng)散的基礎(chǔ)上去有毒性的朱砂而加入壯藥大地棕根成為加味五虎追風(fēng)散。方中蟬蛻既能祛外風(fēng)，又能熄內(nèi)風(fēng)，而解痙止顫；天南星苦溫辛烈，善能開泄以祛風(fēng)解痙，為專治經(jīng)絡(luò)風(fēng)痰的要藥；全蝎、天麻、僵蠶活血化瘀、平熄內(nèi)風(fēng)而止顫；壯藥大地棕根補腎祛風(fēng)行血，全方配伍精煉全面，標(biāo)本兼治，共奏補腎活血、化痰通絡(luò)熄風(fēng)之效。因帕金森病為本虛標(biāo)實之患，腎虛為本病發(fā)病之根本；標(biāo)實為“瘀血”“痰濁”而致經(jīng)氣不利，內(nèi)風(fēng)動越，肢體筋脈失控。故治療當(dāng)標(biāo)本兼顧，以補腎活血、化痰通絡(luò)熄風(fēng)為法[7]。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)五虎追風(fēng)散在治療帕金森病方面有獨特的療效，能改善PD 病人的日常生活能力及運動功能，減少出現(xiàn)異動癥的時間，提高病人的生活質(zhì)量[8-9]。本研究進一步探討加味五虎追風(fēng)散對PD模型大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元α-syn及TH蛋白表達的影響。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，PD病理變化主要表現(xiàn)為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性缺失和路易小體形成，而其中心事件則是異常的α-syn折疊和聚集。α-syn蛋白的錯誤折疊、聚集和降解異常是多巴胺能神經(jīng)元死亡的一個重要因素，在α-syn突變、過度表達及氧化應(yīng)激等多種因素作用下，其異常聚集形成路易小體，并進一步損害多巴胺神經(jīng)元，與 PD 的發(fā)病密切相關(guān)[10-13]。因此，針對α-syn異常聚集的干預(yù)顯得尤為重要，預(yù)先給予抗氧化劑或含巰基的化合物可不同程度地改善PD動物行為和病理生化指標(biāo)的改變[14]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)PD與基因遺傳修飾異常相關(guān)，miRNA 是一類內(nèi)源小分子非編碼RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平參與基因調(diào)控，在PD疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用[15]。研究還發(fā)現(xiàn)，TH負責(zé)催化氨基酸L-酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)槎u基苯丙氨酸，而二羥基苯丙氨酸是多巴胺的前體，因此TH在多巴胺生物合成中發(fā)揮重要作用，TH含量變化與PD的發(fā)生、發(fā)展有著重要聯(lián)系[16]。本實驗發(fā)現(xiàn)，造模后的大鼠α-syn含量明顯增加，與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其行為學(xué)改變達到一定評分，說明PD模型可靠。與模型組相比較，中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組α-syn含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，說明加味五虎追風(fēng)散對α-syn異常聚集起到抑制作用，且要達到一定用藥劑量。在TH含量研究中，與空白組比較，模型組TH含量明顯降低，而中藥低劑量組、中劑量組、高劑量組TH含量較模型組增加，且中藥高劑量組TH含量增加最明顯，與中藥低劑量組、中劑量組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明加味五虎追風(fēng)散能明顯增加PD模型大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH含量，抑制多巴胺的損失，對PD模型大鼠起到了治療效果。

綜上所述，本實驗從PD發(fā)病的關(guān)鍵因素α-syn異常聚集和TH含量變化入手，發(fā)現(xiàn)加味五虎追風(fēng)散對大鼠黑質(zhì)紋狀體區(qū)α-syn異常聚集具有抑制作用，而且能提高TH含量水平，從而對多巴胺能神經(jīng)元有一定的保護作用，為進一步探討加味五虎追風(fēng)散在PD中的靶向治療機制提供了實驗依據(jù)。