香樟SRAP分子標記引物篩選

張麗華 韓浩章 王曉立 李素華 王芳 董蓉 劉宇

摘 要：以香樟嫩葉為試驗材料，采用SRAP-PCR分子標記體系對420對引物組合進行了篩選。結(jié)果表明：共選出19對引物組合，擴增出367條帶，平均19.3條，范圍在15～25條。其中，多態(tài)性帶230條，平均12.11條，范圍在6～17條;多態(tài)性的比例62.16%，范圍在40%～81%。SRAP-PCR分子標記體系穩(wěn)定，篩選出的引物組合可用于不同種源香樟遺傳多樣性及品種鑒定的研究。

關鍵詞：香樟;SRAP分子標記;引物篩選

中圖分類號 S79文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）20-0025-04

Abstract：Using camphor leaves as material，420 primer combinations were screened by SRAP-PCR molecular marker system. The results showed that：a total of 19 pairs of primers were selected，and 367 bands were expanded，with an average of 19.3 and a range of 15～25，of which 230 polymorphic belts，an average of 12.11，a range of 6～17，a polymorphic ratio of 62.16 %，and a range of 40～81 %. The SRAP-PCR molecular marker system is stable，and the selected primer combination can be used for genetic diversity and variety identification of different species of camphor.

Key words：Camphor;SRAP molecular marker;Primer screening

香樟[Cinnamomum camphora（L.） Presl]，又名小葉樟、樟、芳樟，為樟科樟屬常綠喬木，主要分布于中國長江以南地區(qū)，適宜深厚、肥沃的酸性土壤環(huán)境和溫暖、濕潤氣候，不耐干旱、貧瘠和鹽堿土壤環(huán)境，是我國重要的園林綠化樹種、林用樹種和經(jīng)濟樹種。近年來，香樟在我國長江以北地區(qū)的栽培面積越來越廣，但由于引種地與種源生產(chǎn)地之間的氣候和土壤條件差異較大，冬季低溫和土壤鹽堿環(huán)境已成為了限制香樟在我國北方地區(qū)引種栽培成功的關鍵因素，選育抗寒、耐鹽堿品種成為了當務之急[1]。目前，關于香樟優(yōu)良品種選育的研究主要集中在種質(zhì)資源、田間子代生長特性分析以及優(yōu)良家系早期篩選等方面[2]，而關于香樟耐鹽堿、耐寒品種選育研究則相對較少。香樟的生長發(fā)育受環(huán)境的影響很大，地理類型較多，實生后代變異程度大[3-4]，形態(tài)標記、同功酶和染色體核型分析等傳統(tǒng)標記方法很難區(qū)分辨別香樟種間或種內(nèi)關系，而DNA分子標記技術(shù)能在基因組水平上探究植物種間及無性系間的遺傳變異，不受氣候和土壤環(huán)境因素的干擾，所得的信息內(nèi)容豐富，更能體現(xiàn)出植物種內(nèi)和種間的遺傳變異。

相關序列擴增多態(tài)性（Sequence-related amplifiedpolymorphism，SRAP）是Li和Quiros[5]開發(fā)的分子標記技術(shù)。在觀賞南瓜（Cucurbita moschata）[6]、野牛草（Buchloe dactyloides）[7]等植物上的研究表明，SRAP比ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）、SSR（Simple Sequence Repeat）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）等幾種分子標記表現(xiàn)出更豐富的遺傳多樣性，具有操作簡單、多態(tài)性豐富、引物利用率高、重復性好、費用低等優(yōu)點[8]。SRAP標記技術(shù)已廣泛應用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳變異和親緣關系分析和指紋圖譜構(gòu)建等的研究中[9]。關于香樟植物分子標記方面，宋愛云等[4]于2003年將RAPD分子標記技術(shù)應用于鑒定香樟優(yōu)選株和普通株，呂昕謠等[10]也建立了普陀樟的SRAP反應體系，而關于香樟SRAP分子標記方面的研究尚未見報道。為此，本研究采用課題組成熟的SRAP-PCR反應體系，對420對引物進行了篩選，以期為進一步開展香樟的遺傳多樣性及相關遺傳研究提供技術(shù)支撐，也可為香樟基因組分析、分子標記輔助育種等研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 本試驗所選香樟試材共14個樣品（表1），包括浙江、江蘇、江西、安徽等地香樟分布地區(qū)，于2018年2—4月份采集并移栽于宿遷學院樟屬植物種苗基地，2019年4月進行基因組DNA提取。所用SRAP正反向引物參照前人研究公布的引物序列[5-10]，由深圳華大基質(zhì)科技有限公司合成，PCR反應相關試劑10X Buffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA marker均購自天根生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 采用試劑盒法（購自原平皓生物技術(shù)有限公司）提取香樟基因組DNA，采用1% 瓊脂糖凝膠電泳測基因組DNA的質(zhì)量（電泳儀電源為美國BIO-RAD Powerpac Basic型，電泳儀為北京君意JY-SPCT型），電泳結(jié)束后，在自動凝膠圖像分析儀（上海培清JS-780R全自動凝膠成像分析儀）上觀測，確定DNA純度并拍照。用核酸蛋白測定儀（BioPhotometer D30）確定其濃度以及A260/A280的比值，最后將樣品DNA質(zhì)量濃度稀釋到50ng/μL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增體系 SRAP-PCR反應體系為：2.0mmol/L的Mg2+，0.2mmol/L的dNTPs，DNA模板60ng，Taq DNA聚合酶1.5U，正反引物0.5μmol/L，10X loading Buffer 2μL，加ddH2O至20μL。

1.2.3 PCR反應程序 PCR反應程序為：94℃預變性5min，94℃變性1min，35℃復性1min，72℃延伸1min反應5個循環(huán)，94℃變性1min，51℃復性1min，72℃延伸1min反應35個循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。PCR擴增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法染色后，在可見光燈箱上照相記錄。

1.2.4 引物篩選 從供試材料中選取外觀形態(tài)差異較大的3個香樟材料DNA模板對420對SRAP引物進行篩選，最終篩選出清晰度高、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的SRAP引物用于所有DNA樣品擴增（表2）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 對凝膠電泳結(jié)果中清晰、易于辨認的條帶根據(jù)其有無進行統(tǒng)計，同一位點有帶記為“1”，無帶記為“0”，建立二元原始數(shù)字矩陣，并計算擴增產(chǎn)物的多態(tài)位點數(shù)和多態(tài)性百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟DNA的提取檢測 通過測定，14份香樟的DNA樣品的A260/A280的值均數(shù)在1.7～2.0，經(jīng)過0.8%瓊脂糖電泳檢測，其條帶清晰，符合擴增的基本要求（圖1）。

2.2 SRAP分子標記引物組合的篩選及多態(tài)性分析 以14份香樟種源DNA為材料，利用SRAP分子標記體系對420對引物進行篩選，淘汰那些模糊的、條帶較少的引物，選擇出清晰且明亮、條帶數(shù)目多的引物。最終從420對引物組合中選出19對特異性強的引物組合，共獲得367條帶，平均19.3條，范圍在15～25條。其中，多態(tài)性帶230條，平均12.11條，范圍在6～17條;多態(tài)性比例為62.16%，范圍在40%～81%（表3）。

3 討論與結(jié)論

SRAP-PCR反應的引物序列和擴增程序都是特定的，所反映的遺傳多態(tài)性能直接揭示不同植物基因組DNA間的差異[11]。研究認為，SRAP-PCR試驗的結(jié)果與溫度以及Mg2+、dNTPS、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA這5個因素的濃度有關[12]，不同物種的SRAP-PCR研究影響因素的差別也很大，這可能與不同植物本身的遺傳差異有關，也可能與研究者在設定正交設計時不同因素的濃度設定不同有關。此外，不同研究者采用的儀器設備、凝膠的質(zhì)量和濃度均有差異，可能也是造成SRAP-PCR試驗結(jié)果存在差異的原因。因此，適宜的SRAP-PCR反應體系必須針對不同植物種類、不同試驗條件、不同試驗儀器及試劑對主要的影響因素進行優(yōu)化，以保證試驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

目前，關于SRAP分子標記引物篩選的研究較多。郭大龍等[8]從100對SRAP引物組合中，篩選出19對能在葡萄中擴增出條帶清晰且多態(tài)性好的引物組合。安佰義等[12]從176對SRAP引物組合中，篩選出25對適用于白檀的引物組合。李芳芳等[13]從96對SRAP引物組合中，篩選得到18對條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物作為楓香樹基因組的擴增引物組合。本研究中，將20條正向引物和21條反向引物隨機組合得到420對引物組合，其中19個組合能在香樟DNA中擴增出清晰明亮的條帶。由此可見，SRAP引物組合在不同植物的基因組上具有不同的結(jié)合位點及數(shù)量，這導致擴增效果及適用引物存在差異。引物序列是SRAP-PCR擴增過程成功的關鍵，即使建立了最優(yōu)PCR擴增體系，倘若引物的選擇沒有特異性，往往實驗結(jié)果并不理想[11]。

在獲得最優(yōu)PCR擴增體系的基礎上，本研究對420對引物進行了大量的篩選工作，從中初步篩選出19對引物。通過對這些引物進行SRAP-PCR的多態(tài)性數(shù)據(jù)分析，得出總條帶數(shù)為367條。其中，多態(tài)性條帶數(shù)達230條，其擴增產(chǎn)物片段大小均在2000bp以內(nèi)且分布較均勻，多態(tài)率為62.16%。這為香樟的遺傳多樣性研究、品種鑒定、親緣關系分析、遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎。

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（責編：張宏民）