非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)研究進(jìn)展

吳丹 冬冬 李偉 張夏平 趙達(dá)卓

摘 要 非洲豬瘟作為一種新型的外來病毒，在我國發(fā)生疫情后迅速蔓延，引起了嚴(yán)重的豬養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失，非洲豬瘟病毒也因此被我國定位一類動(dòng)物疫情。該病具有高死亡率和高傳染性，最高時(shí)死亡率高達(dá)100%，與部分高溫疾病及豬瘟有類似之處，一般臨床經(jīng)驗(yàn)診斷較為困難，需要借助實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)確診。本文就來分析非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞 非洲豬瘟；實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)；研究進(jìn)展

1 引言

2019年上半年我國豬肉價(jià)格在全國范圍內(nèi)暴漲，平均豬肉價(jià)格漲幅高達(dá)9.3%?？焖偕蠞q的豬肉價(jià)格令市民措手不及。那么豬肉價(jià)格為什么會(huì)漲幅如此之快呢？原因是2018年我國爆發(fā)了非洲豬瘟，對養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的打擊。大部分的中小規(guī)模養(yǎng)豬戶因此陷入經(jīng)濟(jì)危機(jī)，遭到破產(chǎn)，資不抵債。

2 非洲豬瘟的臨床癥狀

非洲豬瘟有著較長的潛伏期，一般由2-9天，平均持續(xù)時(shí)間四天，從病發(fā)到死亡僅需要2-7天。最明顯的臨床癥狀就是高熱癥狀?；加蟹侵挢i瘟的病豬體溫最高是達(dá)到41℃，病豬臨死前48小時(shí)體溫開始下降。此外，病豬表現(xiàn)為食欲不振、行動(dòng)虛弱、脈搏較快、呼吸加速并伴隨呼吸困難，咳嗽加重，還會(huì)患有結(jié)膜炎，伴隨嘔吐、下痢。臨床解剖檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)血紅代辦遞減50%，隨著體溫升高具有白血球性貧血癥，身體匯總的淋巴球數(shù)量也相應(yīng)減少，最低時(shí)下降至40%。身體上表現(xiàn)為蹄、尾、會(huì)陰、腹部、腋下、鼻、耳朵乳頭等部位掉毛，并發(fā)生紫色斑。生斑部位發(fā)生腫脹，斑點(diǎn)中心部位發(fā)生分散性出血癥狀。解剖可見內(nèi)臟多處部位膜內(nèi)發(fā)生紅色瘀斑，胸膜部位發(fā)生新報(bào)出血，多處淋巴部位發(fā)生結(jié)節(jié)。此外，脾臟系統(tǒng)發(fā)生栓塞和腫脹，血液循環(huán)系統(tǒng)發(fā)生多處充血，呼吸系統(tǒng)發(fā)生擴(kuò)散性充血或瘀斑[1]。

3 非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)

3.1 病原學(xué)檢測

3.1.1 病毒分離鑒定

非洲豬瘟病毒分離需要在具有三級(jí)以上生物安全的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。主要包括分離病死豬的心臟、脾臟、肝臟等組織器官，用于分離病毒細(xì)胞。感染非洲豬瘟病毒的病豬單層豬外周血單核細(xì)胞具有血細(xì)胞吸附特性及細(xì)胞死亡的特征。檢測到細(xì)胞呈陽性時(shí)則可確診為感染ASFV病毒。

3.1.2 熒光抗體試驗(yàn)

將采集的白雪細(xì)胞培養(yǎng)物圖片使用ASFV抗原進(jìn)行鑒定，用熒光標(biāo)記抗體分離兵卒，特異性高則為感染非洲豬瘟。該實(shí)驗(yàn)室檢測方法檢測準(zhǔn)確性高，見效快，但由于熒光顯微鏡、熒光標(biāo)記抗體價(jià)格較快，因此檢測應(yīng)用范圍受到限制。

3.1.3 紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)

非洲豬瘟的血紅細(xì)胞通過抗血清阻斷吸附病毒，抗體對同源病毒產(chǎn)生抑制，紅細(xì)胞吸附實(shí)驗(yàn)用于鑒定抗原的差異性和抗體的效價(jià)。大部分的非洲豬瘟分離后具有HAD活性，這類病毒本身不具有致病性。但是這類病毒能夠在白細(xì)胞培養(yǎng)的過程中發(fā)生病變，缺乏紅細(xì)胞吸附能力，而這類病毒具有致病性。再對血紅細(xì)胞的吸附性進(jìn)行鑒定，檢測病毒的敏感性，病毒的敏感性月為92%，這說明存在致病性非洲豬瘟病毒。使用該方法檢測非洲豬瘟病毒，檢測時(shí)間最快也需要3天，長則需要10天，因此不適用于緊急情況病毒檢測。

3.2 血清抗體檢測

3.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)是建立在便宜學(xué)反應(yīng)基礎(chǔ)上的。通過抗體、抗原的反應(yīng)與酶對底物高效催化反應(yīng)的敏感性來監(jiān)測免疫反應(yīng)。2014年，董志珍應(yīng)用基因重組制備非洲豬瘟病毒，從小白鼠身上獲得單克隆抗體，并通過競爭法ELISA檢測非洲豬瘟病毒的特異性，特異性高且無交叉性，其靈敏度為100%。該方法主要用于非洲豬瘟流行病學(xué)的檢測，肥豬豬瘟抗體具有阻斷ELISA、間接ELISA。

3.2.2 膠體金免疫層析技術(shù)

該技術(shù)將膠體金作為示蹤標(biāo)志物，是一種檢測抗原抗體的免疫標(biāo)記技術(shù)。2017年，林彥星等人合成多肽，并將其與牛血清白蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，從中選出具有抗原性的多肽檢測非洲豬瘟抗體膠體金免疫層析紙條。膠體金免疫層析技術(shù)具有較強(qiáng)的敏感性和特異性，試紙檢測方便、快捷，應(yīng)用范圍較廣。膠體金免疫層析試紙檢測非洲豬瘟病毒的準(zhǔn)確率高達(dá)100%，是快速檢測非洲豬瘟最有效的方法，在臨床診斷非洲豬瘟方面有著及其廣泛的應(yīng)用[2]。

3.2.3 間接免疫熒光試驗(yàn)

該技術(shù)是利用特異性抗體與標(biāo)本中相的抗原反應(yīng)來用熒光標(biāo)記抗體檢測病毒的方法。1970年，Sanchez建立了非洲豬瘟抗體IIF檢測技術(shù)。由于IIF具有較高的敏感性，因此使用該技術(shù)檢測非洲豬瘟病毒的時(shí)間較短。在實(shí)際的應(yīng)用中，由于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的檢測結(jié)果不穩(wěn)定，受環(huán)境因素影響較大，因此會(huì)產(chǎn)生非特異性染色，從而影響檢測結(jié)果。

3.3 分子生物學(xué)檢測

分子生物學(xué)檢測主要指核酸檢測法。PCR核酸檢測技術(shù)是一種高敏感性、高特異性檢測技術(shù)，且操作簡單，檢測成本較低，在非洲豬瘟早期病毒診斷方面有著及其廣泛的應(yīng)用。非洲豬瘟病毒基因中含有保守基因序列，根據(jù)非洲豬瘟病毒特異性擴(kuò)增，檢測器核酸章臺(tái)。使用分子生物學(xué)檢測非洲豬瘟，檢測無可以是病豬的分泌物、血液、組織等，不僅對于檢測樣本要求不高，且檢測效果靈敏、迅速。分泌物、血液屬于相對易采集的監(jiān)測樣本，在早期非洲豬瘟病毒診斷檢測方面適用性較好。目前，分子生物監(jiān)測法主要選取非洲豬瘟的P72基因進(jìn)行檢測，它具有高度保守序列設(shè)計(jì)出引物，從中就可提取出病毒樣本[3]。

4 結(jié)語

綜上所述，非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)是目前防控非洲豬瘟最有效的方法。鑒于上一次國內(nèi)爆發(fā)的非洲豬瘟及其因此而造成的慘重的損失，現(xiàn)階段，農(nóng)業(yè)部門應(yīng)該聯(lián)合養(yǎng)殖戶做好豬的自檢與抽檢，確保健康豬肉的流通，為消費(fèi)者提供品質(zhì)保障的豬肉，同時(shí)也優(yōu)化養(yǎng)豬環(huán)境，維持我國養(yǎng)豬業(yè)健康平穩(wěn)發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

[1]王子堅(jiān)，賀奮義，郭慧琳，魏潤生.非洲豬瘟檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].國外畜牧學(xué)（豬與禽），2016（01）：48-49.

[2]劉賀.非洲豬瘟診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019（07）：108-110.

[3]莊金秋，梅建國，謝金文，李峰，沈志強(qiáng).非洲豬瘟病毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法研究進(jìn)展[J].飼料與畜牧，2017（22）：32-36.