間充質(zhì)干細胞移植在治療自身免疫性疾病中的應用進展

束慶，范晴晴，劉蘊星，王丹丹，孫凌云*

（1.南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院藥學部，江蘇 南京210008；2. 南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院風濕免疫科，江蘇 南京210008）

自身免疫性疾?。╝utoimmune diseases）病因復雜，可累及全身多器官多系統(tǒng)，傳統(tǒng)治療方案以糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑為主，而對于部分難治性患者，傳統(tǒng)治療方法效果差，因此，發(fā)展新的有效的治療方法十分重要。

近年來，相關(guān)研究表明：自身免疫性疾病的發(fā)病機制與骨髓環(huán)境的缺陷有關(guān)。干細胞具有高度自我更新能力和多向分化潛能，并且有強大的組織修復和免疫調(diào)節(jié)能力，干細胞移植主要指造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）移植和間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植。HSCs是一種具有多分化潛能的成體干細胞，自20世紀90年代以來，HSCs移植逐漸被用于難治性自身免疫性疾病的治療。意大利學者Marmont等[1]于1996年報道了1例采用自體骨髓移植治療成功救治的重癥系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者，筆者所在課題組于同年在國內(nèi)開展了自體干細胞移植治療多種難治性自身免疫性疾病的研究，包括重癥SLE、類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）、多發(fā)性硬化癥（multiple sclerosis，MS）等，均顯示出一定的療效。HSCs移植可緩解部分患者病情，但由于治療費用高、并發(fā)癥發(fā)生率高，且病情復發(fā)率高達40% ～ 50%，因此難以作為常規(guī)治療方案在臨床推廣[2]。

MSCs是一種主要存在于骨髓中，具有多向分化潛能、低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)特性的成體干細胞。除骨髓外，其亦可從幾乎所有的成體組織中分離培養(yǎng)，如胎盤、臍帶、臍血及脂肪組織。MSCs具有強大的免疫調(diào)節(jié)功能，可誘導免疫耐受，且促進造血和組織修復。研究表明，MSCs存在以下幾個特性：抑制包括T、B淋巴細胞在內(nèi)的多種同種免疫細胞的增殖反應[3]；影響免疫細胞的細胞因子分泌，從而誘導其抗炎作用[4]；可釋放可溶性因子，參與免疫調(diào)節(jié)[5]。此外，MSCs不表達主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅱ類分子，而主要表達MHCⅠ類分子，這使得其具有低免疫原性[6]。

由于具有多向分化潛能、免疫調(diào)節(jié)、造血支持以及低免疫原性、無免疫排斥等特點，近年來MSCs已在難治性和重癥自身免疫性疾病的治療中得到應用，為患者提供了安全有效的新治療選擇。

1 間充質(zhì)干細胞移植治療自身免疫性疾病機制

MSCs可通過抑制T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞（natural killer cells，NKs）和樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的增殖與活化，而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)特性[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者的MSCs存在數(shù)量改變、細胞骨架異常、遷移能力下降、多向分化潛能異常和基礎(chǔ)細胞因子分泌異常等多方面的問題[9-10]。SLE患者MSCs免疫調(diào)節(jié)功能存在異常，使得其抑制T、B淋巴細胞活化，誘導抗體分泌及激活NKs的功能受損，從而導致疾病活動和器官損傷。目前認為，MSCs可抑制多類同種異體免疫細胞的增殖反應[11]，對T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、DCs和NKs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。此外，MSCs可通過分泌多種調(diào)節(jié)細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，如白細胞介素（interleukin，IL）-4、IL-7、IL-10、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）等。

近期臨床前研究結(jié)果進一步闡釋了MSCs通過影響B(tài)淋巴細胞、T淋巴細胞和巨噬細胞參與免疫調(diào)節(jié)的機制。例如，已知異基因MSCs移植對B淋巴細胞有一定的直接或間接抑制作用。MSCs通過可溶性細胞因子影響B(tài)淋巴細胞表面趨化因子的表達[12-13]，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。MSCs亦可通過與IFN-γ協(xié)同作用抑制B淋巴細胞發(fā)揮作用[14]。

SLE患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）數(shù)目和功能均存在異常，Treg在SLE的發(fā)病中扮演重要角色。可溶性人類白細胞抗原G（soluble human leukocyte antigen，sHLA-G）可抑制T細胞增殖、上調(diào)Treg細胞水平[15-17]，是MSCs分泌的關(guān)鍵調(diào)控因子。本課題組近年來的研究提示[18]，SLE患者體內(nèi)sHLA-G表達異常，MSCs可上調(diào)sHLA-G和Treg水平，可能是通過調(diào)控sHLA-G上調(diào)Treg水平來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。此外，本課題組研究顯示：MSCs還可通過調(diào)節(jié)狼瘡轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）和PGE2的表達上調(diào)Treg并下調(diào)輔助性T細胞17（T-helper cell 17，Th17）水平以發(fā)揮治療作用[19]。

巨噬細胞在SLE發(fā)病機制中扮演重要角色。SLE患者巨噬細胞表型、抗炎細胞因子表達、免疫調(diào)節(jié)能力和吞噬功能均存在異常。MSCs可改善SLE患者巨噬細胞表型、免疫調(diào)節(jié)能力和吞噬功能，但對促炎-抗炎相關(guān)因子的產(chǎn)生影響較小。該研究結(jié)果提示MSCs對SLE巨噬細胞的調(diào)控可能是MSCs發(fā)揮治療作用的機制之一[20]。

綜上所述，目前認為MSCs主要通過抑制T淋巴細胞增殖、抑制B淋巴細胞增殖分化、調(diào)節(jié)NKs活性和阻止DCs成熟，從而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)功能，但目前MSCs發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的機制仍未完全闡明，有待進一步探究。

2 間充質(zhì)干細胞移植治療自身免疫性疾病的動物實驗研究

2.1 治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡

本課題組動物研究結(jié)果表明：單用MSCs或合用環(huán)磷酰胺治療SLE模型小鼠MRL/lpr效果優(yōu)于單用環(huán)磷酰胺，分別表現(xiàn)在逆轉(zhuǎn)狼瘡小鼠多器官功能障礙和改善蛋白尿和腎臟病理損害方面[21-22]。此外，研究證實不同來源MSCs在狼瘡模型小鼠研究中均可以控制模型鼠疾病進展，改善疾病表現(xiàn)：臍血來源MSCs也可有效緩解狼瘡模型小鼠病情[23]；脂肪來源MSCs對于狼瘡所造成的免疫系統(tǒng)損害有一定改善作用，可以減輕腎臟的損害[24]。

2.2 治療類風濕關(guān)節(jié)炎

基礎(chǔ)研究顯示，腹腔注射MSCs能夠有效緩解小鼠關(guān)節(jié)炎的癥狀[25]。骨髓來源、脂肪來源和臍血來源等多種MSCs移植治療均能夠有效緩解類風濕關(guān)節(jié)炎模型小鼠的癥狀[26-28]。既往研究認為，由于缺少免疫原性且具有顯著的局部免疫抑制能力，來自臍帶基質(zhì)組織的MSCs可以更安全地用于同種異體移植，不需事先誘導激活即可在體內(nèi)發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，已逐漸替代骨髓來源MSCs[29]。臍帶MSCs的特異性可能是由于基因和蛋白質(zhì)表達譜存在差異，即免疫調(diào)節(jié)表面蛋白如CD200、CD273、CD274，細胞因子如 IL-1β、IL-8、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）和TGF-β2 的表達增加[30]。

2.3 治療多發(fā)性硬化癥

MS是自身免疫相關(guān)性中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病。基礎(chǔ)研究顯示：MSCs通過抑制T淋巴細胞增殖，減少 INF-γ和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達水平，進而改善自身免疫性腦脊髓炎模型小鼠的臨床癥狀；此外，MSCs可聚集于外周免疫器官，使外周T 淋巴細胞發(fā)生免疫耐受［31-32］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β和IL-4也參與MSCs對MS的免疫調(diào)節(jié)[33-34]。

3 間充質(zhì)干細胞移植在治療自身免疫性疾病中的臨床應用

3.1 治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡

SLE是一種以自身抗體形成為主要表現(xiàn)并累及多器官多系統(tǒng)的自身免疫性疾病。SLE常見于育齡期女性，其臨床表現(xiàn)復雜多樣，確切發(fā)病機制尚未證實。目前SLE的主要治療方案為糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，該方案對部分難治性狼瘡患者療效較差，且不良反應較多，對患者生存質(zhì)量影響較大。

本課題組自2007年將異基因骨髓及臍帶來源MSCs移植療法應用于難治性SLE的治療，并開展了相關(guān)臨床研究。研究結(jié)果表明：MSCs移植臨床療效顯著，可穩(wěn)定患者病情，減少患者病情反復；患者接受MSCs移植后無排斥反應，MSCs具有良好的安全性[35-36]。其中一項研究對4名接受異基因骨髓來源MSCs移植治療的患者進行為期12個月的隨訪，結(jié)果顯示該療法對難治性SLE患者的有效性[35]，患者SLE疾病活動度指數(shù)（systemic lupus erythematosus disease activity index，SLEDAI）顯著下降。在此基礎(chǔ)上，本課題組采用異基因骨髓及臍帶來源MSCs移植治療難治性SLE。2010年，15名難治性SLE患者接受骨髓來源異基因MSCs移植治療。隨訪結(jié)果顯示進行MSCs移植的15例患者疾病均得到控制[37]。隨后的臨床研究顯示，臍帶來源MSCs移植可顯著緩解疾病發(fā)展進程[36]。

隨后，本課題組進一步開展了異基因骨髓或臍帶來源MSCs移植治療SLE的Ⅱ期臨床研究[38]。研究納入87例難治性SLE患者，平均隨訪時間為27 個月。結(jié)果顯示，MSCs移植治療具有良好的臨床安全性，無嚴重移植相關(guān)不良反應發(fā)生，第4年隨訪完全緩解率達50% ，整體生存率達94%。隨后又進行了MSCs移植治療SLE的多中心臨床研究，共納入4家中心的40名患者。研究結(jié)果顯示，移植后總體生存率為92.5%，無嚴重移植相關(guān)不良反應發(fā)生[39]。

此外，本課題組針對9名難治性SLE患者長達6年的長期隨訪顯示，MSCs輸注之前和之后6年，血清腫瘤標志物未增加[40]。表明在這類患者中，同種異體臍帶來源MSCs移植治療具有良好的安全性?？梢姡瑢τ陔y治性SLE，MSCs移植治療有較好的安全性。

3.2 治療類風濕關(guān)節(jié)炎

本課題組報道了一項納入了4名RA患者的研究結(jié)果，該研究旨在確定MSCs移植治療在難治性RA中的安全性和有效性[41]。4名RA患者接受了同種異體MSCs移植治療，所有患者均處于疾病活動期。通過視覺模擬量表（visual analogue scale，VAS）、C反應蛋白、紅細胞沉降率和28關(guān)節(jié)疾病活動評分（28 joint disease activity score，DAS-28）來進行療效評估。結(jié)果顯示，移植后1個月和6個月，4名患者中有3名患者的紅細胞沉降率、DAS-28和VAS評分降低。其中2名患者在第6個月達到了歐洲抗風濕聯(lián)盟規(guī)定的緩解要求[42]，研究中無嚴重不良反應發(fā)生。對于難治性RA，異體MSCs移植是安全的，但有效性和治療機制還需研究闡明。

3.3 治療其他自身免疫性疾病

在前期研究基礎(chǔ)上，本課題組予5例重癥系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）患者臍帶來源MSCs移植治療。MSCs移植后，所有患者皮膚厚度評分和生活質(zhì)量評分都顯著改善，血清抗核抗體水平顯著下降，無患者出現(xiàn)移植相關(guān)不良反應。

Cohen等[43]通過對24名患者的試驗，進一步評估自體MSCs移植治療MS的可行性、安全性和耐受性。其中，10例患者為復發(fā)緩解型MS，14例患有繼發(fā)性進行性MS。輸注的平均細胞劑量為1.9×106個/kg，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)嚴重的不良事件或疾病復發(fā)。截至2018年，所有針對MS的注冊臨床試驗仍處于第1階段或第2階段，標準用法為靜脈或鞘內(nèi)注入MSCs 2×106個/kg。

除上述疾病外，目前國內(nèi)外還采用異體MSCs移植治療其他難治性自身免疫性疾病，包括干燥綜合征（Sjogren's syndrome，SS）[44-45]、 皮 肌 炎/多 發(fā)性肌炎（dermatomyositis/polymyositis，DM/PM）[46]， 移植物抗宿主?。╣raft versus-host disease，GVHD）、克羅恩?。–rohn's disease，CD）、1型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1D）、特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）、實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）和急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP），均有良好的療效。

針對SS患者的研究顯示[44]，患者移植后臨床癥狀明顯緩解，疼痛評分、口干量表評分顯著改善。移植后患者接受MSCs移植治療的安全性[50]，共考察包括SLE、SS和SSc在內(nèi)的患者共計404例，考察不良事件主要包括感染和惡性腫瘤。結(jié)果顯示，患者5年和8年生存率分別為90.4%和88.9%，感染發(fā)生率為29.5%（119/404），嚴重感染發(fā)生率為12.9%（52/404），5例患者（1.2%）出現(xiàn)惡性腫瘤；45例患者死亡，移植相關(guān)死亡率為0.2%，研究發(fā)現(xiàn)最常見的死亡原因是疾病復發(fā)和與潛在疾病相關(guān)的并發(fā)癥?？梢?，MSCs移植治療對自身免疫性疾病具有良好的安全性。

4 展望

MSCs具有抗增殖、抗炎癥特性，通過輸注可抑制免疫細胞的活化，從而誘導免疫耐受，且具有不易發(fā)生免疫排斥反應，移植后感染、腫瘤發(fā)生率低等優(yōu)點；其針對自身免疫性疾病的治療已經(jīng)取得了很多成果，為難治性自身免疫性疾病提供了新的治療方法，具有良好的應用前景。但MSCs移植治療自身免疫性疾病在臨床上的應用尚處于初期階段，其對不同自身免疫性疾病的調(diào)控機制尚未完全闡明，在臨床應用中的給藥途徑、劑量、頻次等問題均有待商榷，未來需要多中心的臨床與基礎(chǔ)研究來探明，形成指導性的共識或指南，指導臨床合理應用。靜態(tài)、動態(tài)唾液流率顯著升高，干燥綜合征疾病活動指數(shù)（Sjogren's syndrome disease activity index，SSDAI）顯著改善。10例DM/PM患者（DM 4例，PM 6例）接受異體骨髓或臍帶來源MSCs移植治療，移植后患者總體疼痛評分及手工肌力評分較治療前有明顯改善。移植后6個月，患者血清肌酸激酶、血清肌酸激酶同工酶水平顯著下降[46]。7例炎癥性腸?。╥n flammatory bowel disease，IBD）患者接受骨髓或臍帶來源MSCs移植治療后腹瀉頻率降低、腹痛程度明顯改善，疾病活動指數(shù)顯著降低[47]。3例嚴重的皮膚和黏膜損傷的Stevens-Johnson綜合征患者接受臍帶來源MSCs移植治療后，病變和糜爛皮膚開始脫落，黏膜潰瘍逐漸愈合，隨后，皮膚變干并開始結(jié)痂脫落，新皮膚生長；同時，紅細胞沉降率、C-反應蛋白、白細胞水平均降至正常[48]。本課題組針對MSCs移植治療自身免疫性疾病引起的終末期肝病開展了臨床研究，共納入26例自身免疫性疾病引起的肝硬化患者。移植后6個月、1年和2年，患者丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶平均值下降，總膽紅素平均值下降，平均血清白蛋白水平有所改善，且無嚴重不良事件發(fā)生?？梢?，異體MSCs移植治療對肝硬化患者有明顯的療效且具有良好的安全性，異基因MSCs移植治療是治療自身免疫性疾病所致肝硬化的一種潛在選擇方案[49]。

此外，本課題組回顧性評價了自身免疫性疾病