超聲輔助纖維素酶提取甜菊糖及其抑菌活性研究

郎青云 李慧 祝謝民

摘 要：以甜葉菊為原料，采用超聲輔助纖維素酶法提取甜菊糖，以甜菊糖提取率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法分析得出最佳工藝條件;再用濾紙片法測(cè)定甜菊糖的抑菌活性，用液體培養(yǎng)法測(cè)定甜菊糖的最小抑菌濃度（MIC）。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為纖維素酶量0.5%，超聲時(shí)間35min，超聲溫度50℃，在此條件下，甜菊糖的提取率為18.86%;甜菊糖對(duì)4種供試菌均有抑制作用，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉、根霉的最小抑菌濃度分別為20、40、10、80mg/mL。

關(guān)鍵詞：甜菊糖;響應(yīng)面法;抑菌活性;最小抑菌濃度（MIC）

中圖分類號(hào) TS201.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）21-0030-06

Abstract：Stevia rebaudiana was used as raw material to extract stevioside by cellulase assisted by ultrasound.With the extraction rate of stevioside as the index，the optimum technological conditions were obtained by response surface methodology on the basis of single factor experiments.Then the antimicrobial activity of stevioside was determined by filter paper method，andthe minimum inhibitory concentration （MIC） of stevioside was determined by liquid culture method.The results showed that the optimum extraction conditions were cellulase 0.5%，ultrasonic time 35min and ultrasonic temperature 50 ℃. Under these conditions，the extraction rate of stevioside was 18.86%.Stevioside inhibited all the four tested bacteria，and the minimum inhibitory concentration of stevioside on Escherichia coli，Bacillus subtilis，Mucor and Rhizopus were 20，40，10 and 80 mg/mL，respectively.

Key words： Stevioside;Response face method;Bacterial activity;Minimum inhibitory concentration（MIC）

甜葉菊[Stevia rebaudiana （Bertoni） Hemsl.]是一種菊科甜葉菊屬的多年生草本植物。1977年，甜葉菊從日本引入到南京中山植物園、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院等科研機(jī)構(gòu)。現(xiàn)如今，中國(guó)作為甜葉菊生產(chǎn)國(guó)已躍居世界首位，其出口貿(mào)易排世界首位。目前，我國(guó)甜葉菊主要以原材料或者粗加工的產(chǎn)品出口到發(fā)達(dá)國(guó)家，其精加工生產(chǎn)成品方面的研究仍較少。甜菊糖（Stevioside），又名甜菊糖苷，是一種高甜度、低熱量的新型天然甜味劑[1]，可廣泛應(yīng)用于飲料、蜜餞、果脯、糕點(diǎn)、乳制品或減肥等功能性食品中[2];具有一定藥用價(jià)值，有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎、降血壓、降血脂等功效[3];其產(chǎn)生的工業(yè)廢料，可添加到動(dòng)物飼料和農(nóng)作物肥料中使用[4]。甜菊糖在各行各業(yè)的廣泛應(yīng)用，提高了其市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。

目前，甜菊糖的提取方法主要有水浸提法[5]、溶劑萃取法[6]、連續(xù)逆流提取法[7]及超聲波提取法[8]。其中，超聲波輔助纖維素酶法提取，不僅具有操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、溶劑用量少的優(yōu)點(diǎn)，還可以有效提高甜菊糖的提取率。本課題旨在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法，對(duì)超聲輔助纖維素酶提取甜葉菊中甜菊糖的生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行了抑菌活性的研究，為甜菊糖的深度開發(fā)提供有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 材料：甜葉菊，亳州市譙府茶業(yè)有限公司生產(chǎn)。試劑：纖維素酶，和氏璧生物工程有限公司生產(chǎn);苯酚、濃硫酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇均為分析純。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基。菌種：大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉和根霉，均為蚌埠學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備 分析天平，上海海康電子儀器廠生產(chǎn);高速中藥粉碎機(jī)，吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠生產(chǎn);電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn);超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司生產(chǎn);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司生產(chǎn);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn);可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司生產(chǎn);立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);超凈工作臺(tái)，聚創(chuàng)環(huán)保高新技術(shù)企業(yè)有限公司生產(chǎn);雙目顯微鏡，重慶光電儀器有限公司生產(chǎn);生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取葡萄糖配置成0.2mg/mL葡萄糖溶液。取7支干凈的試管并標(biāo)號(hào)，向其中分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL的0.2mg/mL葡萄糖溶液，定容至2.0mL。再加入5%苯酚溶液1.0mL于7支試管中，振蕩搖勻，緩慢逐滴加入濃硫酸5.0mL，充分搖勻后靜置30min。用0號(hào)管作為空白對(duì)照進(jìn)行調(diào)零，在波長(zhǎng)為490nm處測(cè)定1～6號(hào)管的吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。

1.3.2 原料預(yù)處理 取一定量甜葉菊干葉放入中藥粉碎機(jī)中，粉碎過篩，60℃烘箱中干燥至恒重后，裝入試劑瓶備用。

1.3.3 甜菊糖的提取 稱取甜葉菊粉末按料液比1∶40（mg/mL）加入蒸餾水，0.5%纖維素酶，pH4.5，50℃超聲提取35min，抽濾，向?yàn)V渣中加入等體積的蒸餾水，同等條件二次提取。合并濾液加熱去除蛋白質(zhì)等不溶性物質(zhì)。在25℃條件下，10000r/min，離心10min。離心后，取上清液，濃縮至原體積1/10。加入3倍體積無水乙醇，混合，置于4℃，醇沉12h。在4℃下，4000r/min，離心20min，取出醇沉產(chǎn)物，置于60℃干燥得甜菊糖粗多糖[10]。

1.3.4 甜菊糖提取率的計(jì)算[11] 移取濾液0.5mL，稀釋80倍后，按1.3.1方法測(cè)定490nm波長(zhǎng)下吸光度A，并根據(jù)回歸方程計(jì)算待測(cè)溶液的甜菊糖質(zhì)量濃度。甜菊糖提取率計(jì)算公式如下：

1.3.5 甜菊糖抑菌試驗(yàn)

1.3.5.1 供試菌種的活化與菌懸液的制備 配置斜面固體培養(yǎng)基，用劃線法將4種供試菌種活化（細(xì)菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。挑取1環(huán)無雜菌污染的單菌落于9mL無菌水中，振蕩搖勻，制成一系列菌懸液，濃度約為1.0×106～1.0×108CFU/mL，備用[12]。

1.3.5.2 抑菌效果測(cè)定 濾紙片法抑菌效果測(cè)定：用打孔器獲得6mm圓形濾紙片，與固體培養(yǎng)基、鑷子、涂布棒高壓滅菌（121℃，20min）。滅菌干燥后的濾紙片分別浸泡在不同的甜菊糖溶液（80、40、20、10、5mg/mL）中2h，備用。用涂布法接種供試菌，吸收后，用無菌鑷子夾取濾紙片貼于已涂布有供試菌的平板上，無菌水作為空白對(duì)照，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（細(xì)菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h）。培養(yǎng)后，觀察濾紙片周圍抑菌圈大小并測(cè)量，計(jì)算取平均值。每一菌種做3組平行試驗(yàn)[13]。

1.3.5.3 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 配置80mg/mL的甜菊糖溶液，用二倍稀釋法配置好濃度為40、20、10、5mg/mL的甜菊糖溶液，取不同濃度的甜菊糖稀釋液各0.1mL于試管中，再分別吸取0.1mL菌懸液和5mL液體培養(yǎng)基于對(duì)應(yīng)的試管中均勻混合，以無菌水作為對(duì)照試驗(yàn)。將6支試管放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)（細(xì)菌：37℃，24h;真菌：28℃，48h），觀察菌落的生長(zhǎng)情況，做3組平行試驗(yàn)，將不長(zhǎng)菌的甜菊糖最低濃度作為最小抑菌濃度（MIC）。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn) 分別稱取5份甜葉菊干葉粉末1g，以水為提取液，選取料液比、纖維素酶量、溶液pH、超聲溫度、超聲時(shí)間5個(gè)因素，以甜菊糖提取率為衡量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 依據(jù) Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)甜菊糖提取率有較顯著影響的3個(gè)因素，即纖維素酶量、超聲溫度、超聲時(shí)間。設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)方案，優(yōu)化超聲波輔助纖維素酶提取甜葉菊中甜菊糖的提取工藝，分別用A、B、C代表纖維素酶量（%）、超聲溫度（℃）、超聲時(shí)間（min）3個(gè)因素，用-1、0、1代表變量的3個(gè)水平，對(duì)自變量進(jìn)行編碼，響應(yīng)面分析因素與水平編碼表見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=11.036x-0.0015，R2=0.9995，式中：x為葡萄糖質(zhì)量濃度，mg/mL;y為吸光度，見圖1。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 料液比對(duì)甜菊糖提取率的影響 在纖維素酶量0.5%、溶液pH4.5、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間35min條件下，研究料液比（W/V）1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60對(duì)甜菊糖提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，甜菊糖的提取率在1∶20～1∶40（W/V）料液比，隨著溶劑量的增加而增大，在1∶40（W/V）料液比處出現(xiàn)峰值，此后甜菊糖的提取率呈下降的趨勢(shì)。分析其原因，可能是因?yàn)樘砑尤軇┑牧砍^最適值后，溶劑會(huì)吸收掉部分超聲波輻射，用于溶解雜質(zhì)的溶劑量增多，在樣品提取上的用量卻減少了。故初步判定當(dāng)料液比達(dá)到1∶40（W/V）時(shí)，對(duì)提取甜葉菊中的甜菊糖影響最顯著。

2.2.2 纖維素酶量對(duì)甜菊糖提取率的影響 在料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超聲溫度50℃、超聲時(shí)間35min條件下，研究纖維素酶量0、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%對(duì)甜菊糖提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在0～0.50%纖維素酶量，甜菊糖的提取率不斷升高，并在0.5%纖維素酶量處達(dá)到峰值。當(dāng)纖維素酶量大于0.50%之后，甜菊糖的提取率趨于平緩，這可能是因?yàn)榈孜镆烟幱陲柡蜖顟B(tài)。因此，可初步判定0.50%纖維素酶量對(duì)提取甜葉菊中的甜菊糖影響最顯著。

2.2.3 超聲溫度對(duì)甜菊糖提取率的影響 在纖維素酶酶量0.5%、料液比（W/V）1∶40、溶液pH4.5、超聲時(shí)間35min條件下，研究超聲溫度35、40、45、50、55℃對(duì)甜菊糖提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，在20～50℃，甜菊糖的提取率不斷增大，并在超聲溫度50℃時(shí)達(dá)到峰值。當(dāng)超聲溫度高于50℃之后，甜菊糖的提取率逐漸下降，可能由于超聲溫度達(dá)到50℃時(shí)，纖維素酶活力達(dá)到最大，當(dāng)溫度高于50℃時(shí)，纖維素酶的活力降低，從而影響了甜菊糖的溶出。故可初步判定超聲溫度50℃對(duì)提取甜葉菊的甜菊糖影響最顯著。

2.4.2 最小抑菌濃度 通過抑菌效果測(cè)定實(shí)驗(yàn)分析，甜菊糖對(duì)4種供試菌都有一定的抑制作用。因此，可采用二倍法稀釋甜菊糖溶液加入到液體培養(yǎng)基中，觀察不同供試菌的生長(zhǎng)情況，將培養(yǎng)基中不長(zhǎng)菌時(shí)的甜菊糖最低濃度作為最小抑菌濃度（MIC），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。結(jié)合抑菌效果測(cè)定結(jié)果：當(dāng)甜菊糖濃度較高時(shí)，對(duì)細(xì)菌的抑制效果更顯著，當(dāng)甜菊糖濃度較低時(shí)，對(duì)霉菌的抑制效果更顯著。從表5可以看出，隨著甜菊糖濃度降低，培養(yǎng)基中開始有菌生長(zhǎng)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉、根霉的最小抑菌濃度（MIC）分別為20、40、10、80mg/mL。

3 結(jié)論

本文采用Design Expert 8.0.6 軟件，通過響應(yīng)面分析得到甜菊糖提取率和纖維素酶量、超聲溫度、超聲時(shí)間3因素的模型方程，各因素對(duì)甜菊糖提取率的影響從大到小依次為纖維素酶量>超聲時(shí)間>超聲溫度。最佳提取工藝參數(shù)為纖維素酶0.5%，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間35min，在此條件下，甜菊糖的提取率為18.86%。因此，在保證甜菊糖提取率的前提下，利用超聲波輔助纖維素酶提取甜葉菊中的甜菊糖的提取更為高效。

甜菊糖對(duì)4種供試菌均表現(xiàn)出一定的抑制作用，對(duì)各供試菌的抑菌性大小為大腸桿菌>枯草芽孢桿菌、毛霉>根霉。當(dāng)甜菊糖濃度較高時(shí)，對(duì)細(xì)菌的抑制效果比霉菌更顯著;當(dāng)甜菊糖濃度較低時(shí)，對(duì)霉菌的抑制效果比細(xì)菌更顯著。其中，大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、毛霉、根霉的最小抑菌濃度（MIC）分別為20、40、10、80mg/mL。

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（責(zé)編：張宏民）