• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    辣椒疫霉菌葡聚糖酶抑制蛋白的原核表達、純化及結(jié)晶

    2019-12-09 01:53:17王會征蘭玉彬
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年10期
    關(guān)鍵詞:純化原核表達結(jié)晶

    王會征 蘭玉彬

    摘要:葡聚糖酶抑制蛋白(GIP)是辣椒疫霉菌在病理環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白,是病原菌抗性蛋白的一種。本研究根據(jù)辣椒疫霉菌全基因組序列,通過生物信息學(xué)分析、序列比對獲得葡聚糖酶抑制蛋白全長基因序列。以辣椒疫霉高致病菌株SD33全基因組為模板擴增GIP基因cDNA,并對其進行相關(guān)生物信息學(xué)分析?;蚪?jīng)測序驗證后與載體pET28a(+)連接,構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia coli Rosetta),用IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白6×His-GIP。重組蛋白在5 mol/L尿素變性環(huán)境下進行親和層析純化,對純蛋白進行透析、復(fù)性、濃縮后進行分子排阻層析純化,并對獲得的純蛋白進行蛋白結(jié)晶試驗,為進一步闡明GIP作用機理奠定基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:辣椒疫霉菌;葡聚糖酶抑制蛋白(GIP);原核表達;純化;結(jié)晶

    中圖分類號:S432.4+4:Q78 文獻標(biāo)識號:A 文章編號:1001-4942(2019)10-0111-06

    Prokaryotic Expression, Purification and Crystallization of Glucanase

    Inhibitor Protein (GIP) from Phytophthora capsica

    Wang Huizheng, Lan Yubin

    (College of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology/National Sub-center

    for International Collaboration Research on Precision Agricultural Aviation Pesticide Spraying Technology, Zibo 255000, China)

    Abstract Glucanase inhibitory protein (GIP) is a kind of resistant protein induced by Phytophthora capsici in pathological environment. Based on the whole-genome sequence data of P. capsici, a full-length gene sequence of GIP was obtained by bioinformatics analysis and sequence alignment. The whole genome of highly pathogenic strain P. capsici SD33 was extracted and used as temple for polymerase chain reaction to amplify cDNA of the GIP gene, and related bioinformatics analysis was performed. The gene was verified by sequencing and ligated with the vector pET28a(+), and the constructed recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosetta to express the recombinant protein 6×His-GIP by IPTG induction. The recombinant protein was purified by affinity chromatography in 5 mol/L urea denaturing environment. The purified protein was dialyzed, renatured and concentrated, and then subjected to molecular exclusion chromatography purification. The crystallization experiment using pure protein was carried out, which could provid a basis for clarifying the mechanism of GIP.

    Keywords Phytophthora capsici; Glucanase inhibitor protein(GIP); Prokaryotic expression; Purification; Crystallization

    從病原菌接觸植物到寄主發(fā)病,是病原菌解除寄主防御及寄主抵抗病原菌入侵和繁殖相互斗爭和協(xié)同進化的過程,包含各種信號的傳遞和寄主在細胞、組織、形態(tài)、生理、生化及分子等水平下復(fù)雜的變化過程。研究表明病原菌與寄主互作過程中分泌的細胞壁降解酶等致病酶和致病酶抑制蛋白產(chǎn)生于整個侵染過程中[1,2]。

    在受到病原微生物侵染時,寄主植物分泌內(nèi)切-β-1, 3-葡聚糖酶,以分解來自于真菌和卵菌等病原物細胞壁的β-1, 3-葡聚糖聚合物,是寄主防衛(wèi)機制的一種[3,4]。面對內(nèi)切-β-1, 3-葡聚糖酶的攻擊,疫霉菌等卵菌通過分泌葡聚糖酶抑制蛋白(glucanase inhibitor protein, GIP)表現(xiàn)出抗性[5]。相對于病原物在與寄主互作過程中分泌的葡聚糖酶抑制蛋白,研究更多的是寄主植物產(chǎn)生的β-1, 3-葡聚糖酶[6-8],它通過降解病原物的細胞壁,產(chǎn)生寡聚糖和寡糖激發(fā)子,進而增強寄主植物的抗病性[9]。

    近年來研究較多的是疫霉屬等卵菌病原物中的GIP,如對樟疫霉GIP序列的擴增及不同侵染期表達量的差異性研究等[10]?;蜣D(zhuǎn)錄、翻譯形成的蛋白空間結(jié)構(gòu)是功能基因編碼的蛋白質(zhì)行使生物功能的基礎(chǔ),蛋白質(zhì)各種功能特性均受其空間結(jié)構(gòu)的調(diào)控,不同功能基因均編碼特異空間結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì),由此決定了生命現(xiàn)象的多樣性。因此立足蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究,更易于探明特異功能基因遺傳本質(zhì)與調(diào)控機理。對GIP蛋白結(jié)構(gòu)的研究最早在致病疫霉上[11],從GIP三維結(jié)構(gòu)上闡明了不同基因作用模式的不同。對畢赤酵母GIP結(jié)構(gòu)的研究闡明了其活性喪失的三維結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)特征[12]。

    對辣椒疫霉菌GIP的研究相對較少,尤其是通過蛋白純化、晶體生長進而解析其三維結(jié)構(gòu)的研究目前還未見報道[13]。本研究通過原核表達獲得辣椒疫霉菌GIP純蛋白,進而嘗試進行蛋白質(zhì)結(jié)晶,以期獲得蛋白晶體進而解析其三維結(jié)構(gòu),為研究辣椒疫霉菌GIP作用機理提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    辣椒疫霉菌高致病性菌株SD33,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌及真菌資源利用研究室分離獲得并保存;表達載體pET28a(+)(Novagen公司);大腸桿菌菌株(Escherichia coli) BL21 (DE3)、E. coli Rosetta、pEASY-T3載體、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ等,購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;T4 DNA連接酶、rTaq酶、dNTP、卡那霉素、DNA Marker、蛋白Marker等,購自寶生物工程(大連)有限公司;Tris、NaCl、咪唑等蛋白純化及晶體生長所需超純生化試劑,購自上海Sigma公司; IPTG、SDS、乙醇、鹽酸等其它試劑為國產(chǎn)分析純。

    1.2 基因GIP的生物信息學(xué)分析

    通過比對、分析辣椒疫霉菌基因組(JGI: http://genome.jgi-psf.org/Phyca11/Phyca11.home.html)全序列信息獲得葡聚糖酶抑制蛋白基因GIP序列信息,利用https://web.expasy.org/protparam/在線分析GIP基因編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點等;蛋白質(zhì)序列的跨膜區(qū)分析和信號肽分析分別利用TMHMM Server v. 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP 4.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)在線軟件進行分析;利用Protean軟件對GIP二級結(jié)構(gòu)組成、親疏水性等性質(zhì)進行預(yù)測及分析。

    1.3 基因克隆及原核表達載體構(gòu)建

    通過獲得的葡聚糖酶抑制蛋白基因GIP核苷酸序列信息設(shè)計引物,正向引物為GIP-F:5′- CGCGGATCCGAACACGTTGAACGTCAGCTT-3′(下劃線部分為BamHⅠ酶切位點),反向引物為GIP-F:5′- CCGGAATTCTTATTTCGTGACGGAGTTGAT -3′(下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)?;蚩寺≥d體為pEASY-T3載體,原核表達載體為pET28a(+),以辣椒疫霉高致病菌株SD33全基因組為模板擴增GIP基因的cDNA,基因克隆與原核表達載體構(gòu)建具體步驟參照文獻[14]。

    1.4 重組質(zhì)粒pET28a/GIP的鑒定及誘導(dǎo)表達

    采用PCR擴增、酶切驗證篩選陽性克隆重組質(zhì)粒pET28a/GIP,由濟南博尚生物技術(shù)有限公司進行測序驗證。將測序驗證后的陽性克隆提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta菌株,過夜培養(yǎng)后挑取單菌落用5 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基于37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600值達0.4~0.6。菌液分別加入終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG,于16℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)20 h,SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白表達情況,確定最佳誘導(dǎo)條件并進行大量誘導(dǎo)表達含有6個組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白6×His-GIP,收集菌液備用。

    1.5 重組蛋白6×His-GIP的純化

    在普通重懸緩沖液A(20 mmol/L Tris,pH 8.5;150 mmol/L NaCl)并添加一定的超聲輔助緩沖液B[10%(V/V)甘油,5 mmol/L β-巰基乙醇,0.5%(V/V)Tween-20]下重組蛋白為包涵體,更換含有尿素的緩沖液C(緩沖液A+5 mol/L尿素)重懸沉淀即可使沉淀溶解,4℃、15 000 r/min離心30 min,取上清按照Ni-NTA蛋白純化試劑盒操作說明對重組蛋白6×His-GIP進行純化。其中洗雜液為緩沖液D(緩沖液C+20 mmol/L咪唑),洗雜500 mL左右;洗脫液為緩沖液E(緩沖液C+500 mmol/L咪唑),洗脫20 mL左右;對洗脫液進行低溫過夜透析,透析液分別為緩沖液A+3 mol/L尿素、緩沖液A+1 mol/L尿素、緩沖液A,直至除去尿素,對重組純蛋白進行復(fù)性。

    對親和層析純化后復(fù)性純蛋白進行分子排阻層析純化,純化所用緩沖液為緩沖液A+5 mmol/L DTT,所用層析柱為Superdex-75。

    1.6 重組蛋白6×His-GIP的結(jié)晶

    對層析純化后的重組蛋白6×His-GIP采用氣相擴散、坐滴法進行蛋白結(jié)晶嘗試,選用Hampton Research試劑盒Crystal ScreenⅠ和Ⅱ、PEG/Ion ScreenTM、Salt RxTM1等進行晶體生長條件初篩,蛋白濃度選用2、5、10 mg/mL,溫度選用20℃。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 GIP的理化性質(zhì)及生物信息學(xué)分析

    辣椒疫霉菌葡聚糖酶抑制蛋白基因GIP序列全長為777 bp,最大開放閱讀框 (ORF) 長774 bp,ORF編碼一個含258個氨基酸殘基的蛋白質(zhì),預(yù)測編碼產(chǎn)物大小約為24.7 kD,無跨膜區(qū),信號肽含有20個氨基酸殘基,5個半胱氨酸,等電點為4.85?;纠砘再|(zhì)見表1。

    對GIP的二級結(jié)構(gòu)組成、親疏水性等性質(zhì)進行預(yù)測與分析。由圖1可知,組成GIP的二級結(jié)構(gòu)主要為β折疊,α螺旋和不規(guī)則卷曲較少;疏水性區(qū)域相對較多,這和后續(xù)蛋白純化過程中GIP較難溶相吻合。

    2.2 GIP基因cDNA的PCR擴增

    GIP基因PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳,獲得與預(yù)期結(jié)果一致的條帶(圖2),大小約777 bp。擴增基因測序結(jié)果與公布的辣椒疫霉菌全基因組GIP基因比對,發(fā)現(xiàn)存在12個堿基位點的差異,翻譯成氨基酸后的序列存在3個位點的差異,可能是由于菌株小種?;筒煌斐傻?。

    2.3 GIP基因cDNA的原核表達

    將測序驗證后的GIP基因cDNA與表達載體pET28a(+)連接轉(zhuǎn)化E. coli Rosetta表達菌株,菌液經(jīng)不同濃度IPTG誘導(dǎo),以空載體原核表達產(chǎn)物為陰性對照,通過SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白6×His-GIP表達情況,發(fā)現(xiàn)在28 kD左右出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶(圖3),不同IPTG濃度對重組蛋白表達量影響不大。最終確定誘導(dǎo)條件為0.1 mmol/L的IPTG 16℃下誘導(dǎo)20 h左右收集菌液,1 L菌液中大約收集3 g的菌體。

    2.4 重組蛋白6×His-GIP的純化及復(fù)性

    重組蛋白在普通緩沖液A或添加增溶劑B下均以包涵體的形式存在,在緩沖液中添加尿素至5 mol/L時目標(biāo)蛋白溶解,因重組蛋白含有His標(biāo)簽,所以使用Ni柱進行親和層析純化。蛋白經(jīng)掛柱、洗雜、洗脫后以單一條帶出現(xiàn)在SDS-PAGE蛋白凝膠上(圖4)。掛柱后的流穿液仍有較多重組蛋白,可能與Ni柱的有效載量或變性后的蛋白親和層析特異性較低、相對容易被洗雜液洗脫下來等因素有關(guān)。

    對洗脫蛋白采取低溫過夜透析、逐漸降低尿素濃度的方法進行復(fù)性,復(fù)性后的重組蛋白6×His-GIP以可溶形式存在于普通緩沖液A中,利于下游試驗,但蛋白濃度有所下降(圖4),即目標(biāo)蛋白在復(fù)性過程中有所損失,部分蛋白復(fù)性未成功而形成沉淀。對親和層析純化后復(fù)性純蛋白濃縮后進行分子排阻層析純化,并對單一峰值下的蛋白進行收集并濃縮以進行下游結(jié)晶試驗。分子排阻層析純化后的重組蛋白6×His-GIP為單一峰,但對峰值下的蛋白收集濃縮后經(jīng)SDS-PAGE分析出現(xiàn)緊鄰的兩條條帶(圖5),此蛋白在高濃度下可能發(fā)生了寡聚化作用或生成了二硫鍵。

    2.5 純蛋白6×His-GIP的結(jié)晶

    對純蛋白6×His-GIP進行酶活性測定(相關(guān)結(jié)果另文發(fā)表),顯示純蛋白6×His-GIP具有活性。對蛋白進行結(jié)晶嘗試,發(fā)現(xiàn)形成了一定大小的晶核(圖6),但至今未生長出質(zhì)量較好的蛋白晶體,目前正在繼續(xù)優(yōu)化結(jié)晶條件。

    3 討論與結(jié)論

    葡聚糖酶抑制蛋白GIP是與病程相關(guān)蛋白類似的一種抗性蛋白,研究較多的是存在于寄主植物上且能引發(fā)寄主防衛(wèi)反應(yīng)的GIP分泌蛋白[3,4],而產(chǎn)生于病原菌的GIP與寄主植物的區(qū)別在于此蛋白為病原菌本身在病理或病理相關(guān)環(huán)境下誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白,是病原菌對寄主植物抗性反應(yīng)表現(xiàn)出來的自身抗性反應(yīng)。

    2008年辣椒疫霉菌全基因組序列草圖由美國能源部基因研究所公布于眾(http://genome.jgi-psf.org/Phyca11/Phyca11.home.html)并不斷更新完善。通過生物信息學(xué)分析,越來越多人們感興趣的基因被發(fā)現(xiàn)進而為揭示其相關(guān)功能并被人們利用提供了便利。通過生物信息學(xué)分析我們首次從高致病性辣椒疫霉菌菌株SD33上克隆到GIP基因,與公布的基因組序列存在微小差異,可能是因為測序菌株與本試驗所用菌株小種專化型的不同造成的,并不影響基因的功能特性。

    近年來,借助基因組學(xué)和分子遺傳學(xué)技術(shù),開展了系列植物病原菌致病因子功能特性及其致病機制研究,取得了若干有價值的研究結(jié)果,但對病原菌抗病因子的研究資料匱乏。本研究選取抗病因子GIP為研究對象,試圖解析其三維結(jié)構(gòu)即從原子水平探明其遺傳本質(zhì)與調(diào)控機理,其基礎(chǔ)就在于獲得GIP純蛋白并生長出蛋白晶體。

    本研究利用pET系統(tǒng)構(gòu)建了GIP原核表達體系,在試用E. coli BL21 (DE3)菌株未表達出重組蛋白時改用E. coli Rosetta菌株成功表達出目的蛋白,為表達真核基因尤其是含稀有密碼子的基因提供了借鑒。對表達出的重組蛋白采用低濃度誘導(dǎo)劑、低溫長時間誘導(dǎo)的策略使重組蛋白充分折疊以免形成包涵體,但表達出的重組蛋白6×His-GIP在普通緩沖液或添加增溶劑下均以包涵體的形式存在。綜合考慮蛋白回收率及后期蛋白復(fù)性、結(jié)晶等因素,我們選擇在5 mol/L尿素濃度下進行純化及復(fù)性,并通過分子排阻層析進行再純化,但濃縮后的蛋白可能發(fā)生了寡聚化作用或生成了二硫鍵,即蛋白的均一性不夠高,這也是在后續(xù)結(jié)晶試驗時只能形成晶核但未成功培養(yǎng)出較好晶體的原因之一。在后續(xù)試驗中我們將通過提高蛋白純度及均一性或嘗試真核表達得到較高純度及均一性GIP蛋白,進而培養(yǎng)出適宜解析其三維結(jié)構(gòu)的蛋白晶體,以期從更深層闡明GIP作用機理。

    參 考 文 獻:

    [1]Kikot G E, Hours R A, Alconada T M. Contribution of cell wall degrading enzymes to pathogenesis of Fusarium graminearum: a review[J]. Journal of Basic Microbiology, 2009, 49(3): 231-241.

    [2]Kamoun S. A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic Oomycetes[J]. Annual Review of Phytopathology, 2006, 44(1): 41-60.

    [3]Kauffmann S, Legrand M, Geoffroy P, et al. Biological function of pathogenesis-related proteins: four PR proteins of tobacco have 1, 3-beta-glucanase activity[J]. EMBO Journal, 1987, 6(11): 3209-3212.

    [4]Stintzi A, Heitz T, Prasad V, et al. Plant ‘pathogenesis-related proteins and their role in defense against pathogens[J]. Biochimie, 1993, 75(8): 687-706.

    [5]Ham K S, Wu S C, Darvill A G, et al. Fungal pathogens secrete an inhibitor protein that distinguishes isoforms of plant pathogenesis-related endo-1, 3-glucanases[J]. The Plant Journal, 2002, 11(2): 169-179.

    [6]趙爽, 楊柳, 楊亮, 等. 煙草β-1, 3-葡聚糖酶的蛋白序列分析[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 24(10): 6-9.

    [7]馬世明, 羅家佐, 王德勛, 等. 煙草β-1, 3-葡聚糖酶的生物學(xué)分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 46(17): 96-97, 116.

    [8]管翠萍, 王俊文, 王麗娟, 等. 枸杞LbXEGIP1基因的克隆與生物信息學(xué)分析[J]. 分子植物育種, 2018, 16(19): 6235-6241.

    [9]蔣選利, 李振岐, 康振生. β-1, 3-葡聚糖酶與植物的抗病性[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2005, 14(4): 135-139.

    [10]Martins I M, Martins F, Belo H, et al. Cloning, characterization and in vitro and in planta expression of a glucanase inhibitor protein (GIP) of Phytophthora cinnamomi[J]. Molecular Biology Reports, 2014, 41(4): 2453-2462.

    [11]Damasceno C M B, Bishop J G, Ripoll D R, et al. Structure of the glucanase inhibitor protein (GIP) family from Phytophthora species suggests coevolution with plant endo-beta-1, 3-glucanases[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2008, 21(6): 820-830.

    [12]Scarafoni A, Consonni A, Pessina S, et al. Structural basis of the lack of endo-glucanase inhibitory activity of Lupinus albus γ-conglutin[J]. Plant Physiology and Biochemistry, 2016, 99: 79-85.

    [13]George K J, Babu O R, Kumar I P V, et al. Interplay of genes in plant-pathogen interactions: in planta expression and docking studies of a beta 1, 3 glucanase gene from Piper colubrinum and a glucanase inhibitor gene from Phytophthora capsici[J]. Physiology & Molecular Biology of Plants An International Journal of Functional Plant Biology, 2016, 22(4): 567-573.

    [14]Zhang X G, Li F, Wang H Z. Comparison of expression, purification and characterization of a new pectate lyase from Phytophthora capsici using two different methods[J]. BMC Biotechnology, 2011, 11(32): 1-7.

    收稿日期:2019-07-12

    基金項目:山東省引進頂尖人才“一事一議”專項經(jīng)費資助項目;淄博市科技發(fā)展計劃資助項目(2018kj010073)

    通訊作者:王會征(1984—),男,博士,講師,研究方向為植物病害及其致病機理。E-mail: hzwang@sdut.edu.cn

    猜你喜歡
    純化原核表達結(jié)晶
    “長大”的結(jié)晶
    纈草黃酮純化工藝研究
    柑橘CitSERK—LIKE基因原核表達載體的構(gòu)建與表達
    共聚甲醛的自成核結(jié)晶行為
    中國塑料(2016年9期)2016-06-13 03:18:50
    瑞加德松的全合成研究
    高純氫氣純化技術(shù)研究
    科技視界(2015年30期)2015-10-22 10:13:55
    信號分子與葉銹菌誘導(dǎo)下小麥病程相關(guān)蛋白1基因的表達分析
    大腸桿菌中重組尖吻蝮蛇類凝血酶的純化及鑒定
    科技資訊(2015年20期)2015-10-15 19:47:25
    sPS/PBA-aPS共混物的結(jié)晶與熔融行為
    中國塑料(2015年7期)2015-10-14 01:02:40
    山桃醇腈酶基因PdHNL1的克隆、序列分析與原核表達
    亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久视频综合| 欧美久久黑人一区二区| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 国产成人影院久久av| 操美女的视频在线观看| 色播在线永久视频| 不卡一级毛片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美精品av麻豆av| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日本中文国产一区发布| 操出白浆在线播放| 午夜福利视频精品| 老熟妇仑乱视频hdxx| 高清视频免费观看一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久ye,这里只有精品| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 亚洲成人免费av在线播放| 久久久水蜜桃国产精品网| 免费高清在线观看视频在线观看| 91老司机精品| 久久久久久人人人人人| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产免费视频播放在线视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 国产三级黄色录像| 一进一出抽搐动态| 在线观看舔阴道视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 日韩三级视频一区二区三区| 一区在线观看完整版| 人人澡人人妻人| 一边摸一边做爽爽视频免费| 男女床上黄色一级片免费看| 欧美成狂野欧美在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美 日韩 精品 国产| 热99久久久久精品小说推荐| 两性夫妻黄色片| 精品一区二区三区av网在线观看 | 狠狠精品人妻久久久久久综合| 91精品三级在线观看| 国产黄频视频在线观看| 欧美久久黑人一区二区| 午夜视频精品福利| 亚洲av电影在线进入| 久久精品久久久久久噜噜老黄| xxxhd国产人妻xxx| 99久久人妻综合| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 日本一区二区免费在线视频| 9191精品国产免费久久| 国产人伦9x9x在线观看| 久久久久久人人人人人| 女性生殖器流出的白浆| 欧美日韩视频精品一区| 99国产精品99久久久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 丝袜美腿诱惑在线| av网站在线播放免费| 国产精品熟女久久久久浪| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 51午夜福利影视在线观看| 大码成人一级视频| 老司机亚洲免费影院| 亚洲第一av免费看| 中国美女看黄片| 制服人妻中文乱码| 丰满饥渴人妻一区二区三| 深夜精品福利| 精品一区二区三区四区五区乱码| www日本在线高清视频| 亚洲第一av免费看| 超色免费av| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩一区二区三区影片| 大香蕉久久网| 各种免费的搞黄视频| 老司机深夜福利视频在线观看 | 久久影院123| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 日本黄色日本黄色录像| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 精品少妇久久久久久888优播| 中文字幕精品免费在线观看视频| 午夜激情av网站| 亚洲全国av大片| 午夜免费观看性视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 满18在线观看网站| 男人操女人黄网站| 国产精品免费大片| 丁香六月欧美| 一级a爱视频在线免费观看| 丁香六月天网| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 窝窝影院91人妻| 自线自在国产av| 大陆偷拍与自拍| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 色婷婷久久久亚洲欧美| 国产欧美日韩一区二区三 | 国产精品久久久久久精品电影小说| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美日韩视频精品一区| 超碰成人久久| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 亚洲精品自拍成人| 99国产精品99久久久久| 国产主播在线观看一区二区| 精品国产乱码久久久久久小说| 精品卡一卡二卡四卡免费| 一个人免费看片子| 免费人妻精品一区二区三区视频| 精品高清国产在线一区| 日韩精品免费视频一区二区三区| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产免费一区二区三区四区乱码| 两个人免费观看高清视频| a在线观看视频网站| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲精品成人av观看孕妇| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 99久久综合免费| 无遮挡黄片免费观看| 伊人亚洲综合成人网| 欧美久久黑人一区二区| 少妇精品久久久久久久| 免费高清在线观看视频在线观看| 丝袜美足系列| 国产免费av片在线观看野外av| 91国产中文字幕| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 男女之事视频高清在线观看| 91老司机精品| 天天影视国产精品| 久9热在线精品视频| 99九九在线精品视频| 国产又爽黄色视频| 国产色视频综合| 亚洲av片天天在线观看| 热99久久久久精品小说推荐| 国产一区二区在线观看av| 五月天丁香电影| 欧美黄色片欧美黄色片| 日本vs欧美在线观看视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 他把我摸到了高潮在线观看 | 丁香六月欧美| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲国产av新网站| 久热爱精品视频在线9| 亚洲久久久国产精品| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产男女内射视频| 成人国产一区最新在线观看| 大陆偷拍与自拍| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 精品第一国产精品| 国产在线观看jvid| 久久久国产成人免费| 丝袜美足系列| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产精品一区二区在线观看99| 免费人妻精品一区二区三区视频| 多毛熟女@视频| 亚洲一区中文字幕在线| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 免费高清在线观看日韩| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| av一本久久久久| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成人免费av在线播放| 欧美激情高清一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲专区国产一区二区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精华国产精华精| 日韩大片免费观看网站| 中文字幕高清在线视频| 婷婷成人精品国产| 国产欧美日韩一区二区三 | 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲成人手机| 国产亚洲一区二区精品| 两个人免费观看高清视频| 人成视频在线观看免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲全国av大片| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲激情五月婷婷啪啪| svipshipincom国产片| 无限看片的www在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产三级黄色录像| 久久久国产成人免费| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 丁香六月天网| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久香蕉激情| 男男h啪啪无遮挡| 欧美+亚洲+日韩+国产| 性高湖久久久久久久久免费观看| 亚洲天堂av无毛| 91老司机精品| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产精品国产av在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 色老头精品视频在线观看| 精品人妻在线不人妻| 亚洲一码二码三码区别大吗| 大片电影免费在线观看免费| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产有黄有色有爽视频| 99久久精品国产亚洲精品| 色视频在线一区二区三区| 纯流量卡能插随身wifi吗| videosex国产| 少妇人妻久久综合中文| 搡老熟女国产l中国老女人| 丝袜喷水一区| 51午夜福利影视在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 五月天丁香电影| 日韩欧美一区视频在线观看| 电影成人av| 高清在线国产一区| 激情视频va一区二区三区| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产成人av教育| 午夜91福利影院| 久久亚洲精品不卡| 首页视频小说图片口味搜索| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人影院久久av| 亚洲专区字幕在线| 黑丝袜美女国产一区| 久久国产精品人妻蜜桃| 午夜福利一区二区在线看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 999久久久国产精品视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 一区二区三区乱码不卡18| www.999成人在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 波多野结衣av一区二区av| 久久香蕉激情| 999精品在线视频| 久久免费观看电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 91成年电影在线观看| 久久久精品94久久精品| 久久久久久人人人人人| 精品少妇黑人巨大在线播放| 12—13女人毛片做爰片一| 精品少妇黑人巨大在线播放| 日韩有码中文字幕| netflix在线观看网站| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲人成电影观看| 中文字幕av电影在线播放| av线在线观看网站| 亚洲一码二码三码区别大吗| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久狼人影院| 欧美精品一区二区免费开放| 欧美国产精品一级二级三级| 曰老女人黄片| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜免费鲁丝| www.999成人在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 在线观看人妻少妇| 亚洲免费av在线视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费人妻精品一区二区三区视频| 麻豆乱淫一区二区| 超色免费av| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 十分钟在线观看高清视频www| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 不卡一级毛片| 亚洲熟女精品中文字幕| 妹子高潮喷水视频| 成人手机av| 水蜜桃什么品种好| 亚洲av日韩在线播放| 色播在线永久视频| 国产男女超爽视频在线观看| 精品少妇内射三级| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 青青草视频在线视频观看| 考比视频在线观看| av一本久久久久| 亚洲国产看品久久| 国产亚洲欧美精品永久| 日本欧美视频一区| 成人国语在线视频| 无遮挡黄片免费观看| 精品一区二区三区四区五区乱码| 丝瓜视频免费看黄片| 国产av又大| 亚洲三区欧美一区| 青草久久国产| 999精品在线视频| 黄片大片在线免费观看| 亚洲精品在线美女| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产亚洲av高清不卡| 精品福利永久在线观看| 欧美精品亚洲一区二区| 久久久久久久久久久久大奶| 国产精品1区2区在线观看. | 精品乱码久久久久久99久播| 正在播放国产对白刺激| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 成人国语在线视频| 国产精品久久久av美女十八| 老司机福利观看| 亚洲成人免费av在线播放| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲天堂av无毛| 国产精品久久久久久精品古装| 最新的欧美精品一区二区| 午夜91福利影院| kizo精华| 国产麻豆69| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 久久久久视频综合| 欧美日韩黄片免| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 人人澡人人妻人| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 在线观看免费日韩欧美大片| 一区二区三区乱码不卡18| 99re6热这里在线精品视频| 精品欧美一区二区三区在线| 不卡一级毛片| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产av国产精品国产| av欧美777| 日本wwww免费看| 秋霞在线观看毛片| 国产精品av久久久久免费| 中国国产av一级| 啦啦啦免费观看视频1| 一区在线观看完整版| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产一区二区激情短视频 | 国产不卡av网站在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产精品国产av在线观看| 日本vs欧美在线观看视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 最近中文字幕2019免费版| 久久热在线av| 亚洲第一av免费看| av福利片在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲天堂av无毛| 九色亚洲精品在线播放| 久久国产精品大桥未久av| 制服人妻中文乱码| 搡老岳熟女国产| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产免费福利视频在线观看| 中文字幕高清在线视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 日本欧美视频一区| 久久久精品94久久精品| 国产精品二区激情视频| 午夜免费鲁丝| 国产成人精品在线电影| 日韩免费高清中文字幕av| 免费观看人在逋| 丰满少妇做爰视频| 黄色视频不卡| 亚洲精品国产色婷婷电影| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 母亲3免费完整高清在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 老熟妇仑乱视频hdxx| 又大又爽又粗| 色老头精品视频在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 成人影院久久| 国产xxxxx性猛交| 99热国产这里只有精品6| 欧美精品亚洲一区二区| 中文字幕人妻丝袜制服| 国精品久久久久久国模美| 考比视频在线观看| 大码成人一级视频| 老熟女久久久| 久久香蕉激情| 亚洲熟女毛片儿| 国产福利在线免费观看视频| netflix在线观看网站| 亚洲国产日韩一区二区| 久久影院123| 成年动漫av网址| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一级片'在线观看视频| 国产免费av片在线观看野外av| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 午夜福利免费观看在线| 五月天丁香电影| 18在线观看网站| 少妇粗大呻吟视频| 两人在一起打扑克的视频| 欧美在线黄色| 丰满迷人的少妇在线观看| 岛国毛片在线播放| 我要看黄色一级片免费的| 国产精品 国内视频| 妹子高潮喷水视频| 国产色视频综合| 久久久精品区二区三区| 久久精品成人免费网站| 欧美国产精品va在线观看不卡| 99精品欧美一区二区三区四区| svipshipincom国产片| 亚洲国产看品久久| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 欧美日韩成人在线一区二区| 91精品伊人久久大香线蕉| 男女床上黄色一级片免费看| 制服人妻中文乱码| a级片在线免费高清观看视频| 国产精品一区二区免费欧美 | 欧美性长视频在线观看| 国产成人影院久久av| 欧美日韩亚洲高清精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| avwww免费| 久久热在线av| 最近中文字幕2019免费版| 丝袜脚勾引网站| 制服诱惑二区| 极品少妇高潮喷水抽搐| av一本久久久久| 大香蕉久久网| 色老头精品视频在线观看| 国产黄频视频在线观看| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 女人久久www免费人成看片| 不卡av一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 桃花免费在线播放| 99国产极品粉嫩在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 悠悠久久av| 国产精品偷伦视频观看了| 亚洲三区欧美一区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美97在线视频| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲国产av影院在线观看| 乱人伦中国视频| 国产成人av教育| 91字幕亚洲| 一区二区av电影网| 成人av一区二区三区在线看 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 免费高清在线观看日韩| 亚洲av片天天在线观看| 国产伦人伦偷精品视频| 不卡av一区二区三区| 满18在线观看网站| 成年人午夜在线观看视频| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产97色在线日韩免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 在线观看人妻少妇| 大码成人一级视频| 亚洲国产看品久久| √禁漫天堂资源中文www| 人妻 亚洲 视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产一卡二卡三卡精品| 中国国产av一级| 99re6热这里在线精品视频| 黄色怎么调成土黄色| 大香蕉久久网| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲九九香蕉| 免费日韩欧美在线观看| 高清黄色对白视频在线免费看| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 久久热在线av| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日日爽夜夜爽网站| 久久久国产精品麻豆| 黑人操中国人逼视频| 国产有黄有色有爽视频| 女性被躁到高潮视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 一级黄色大片毛片| 国产色视频综合| 中文字幕制服av| 免费不卡黄色视频| 免费少妇av软件| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 亚洲精品一区蜜桃| 十分钟在线观看高清视频www| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 欧美中文综合在线视频| 久久久欧美国产精品| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 中文字幕av电影在线播放| 国产精品.久久久| 国产亚洲欧美精品永久| 在线永久观看黄色视频| 人人澡人人妻人| 性高湖久久久久久久久免费观看| 一区二区三区乱码不卡18| 高清黄色对白视频在线免费看| 九色亚洲精品在线播放| 久久性视频一级片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 操美女的视频在线观看| 日韩视频在线欧美| 国产片内射在线| 十八禁网站免费在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲性夜色夜夜综合| 美女国产高潮福利片在线看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 两人在一起打扑克的视频| 欧美97在线视频| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲成人手机| 国产免费福利视频在线观看| 久久国产精品影院| 两性夫妻黄色片| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 国产一区有黄有色的免费视频| 国产亚洲欧美精品永久| 国产一卡二卡三卡精品| 窝窝影院91人妻| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美乱码精品一区二区三区| 男女下面插进去视频免费观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 波多野结衣一区麻豆| av线在线观看网站| av网站在线播放免费| 亚洲国产精品999| 亚洲国产欧美网| 亚洲一码二码三码区别大吗| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 免费在线观看黄色视频的| 波多野结衣av一区二区av| 精品一区在线观看国产| 国产伦理片在线播放av一区| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲av电影在线进入| a级毛片黄视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲精品一区蜜桃| √禁漫天堂资源中文www| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 大片电影免费在线观看免费| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产免费一区二区三区四区乱码| cao死你这个sao货| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 操出白浆在线播放| 日韩视频在线欧美|