下丘腦胰島素抵抗在多囊卵巢綜合征排卵障礙中的作用

馬玲，劉振華，陳皓，劉鳳 (長(zhǎng)江大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，湖北 荊州 434000)

易清華 (長(zhǎng)江大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 荊州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 荊州 434000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是由卵巢泡膜細(xì)胞良性增生引起的高雄激素血癥、持續(xù)性排卵障礙和卵巢多囊性改變?yōu)橹饕卣鞯呐R床疾病，一般在青春期前后發(fā)病[1]。PCOS是導(dǎo)致育齡期婦女不孕的最常見原因之一，患病率為5%～10%[2]。該病臨床表現(xiàn)為月經(jīng)異常、肥胖等，并有高脂血癥、糖尿病等多種代謝并發(fā)癥，伴有明顯的胰島素抵抗(IR)[3]。國(guó)內(nèi)外臨床研究證實(shí)，PCOS患者中，50%～60%存在IR。1980年Burghen等首次提出IR參與PCOS的發(fā)病過(guò)程[4]。有醫(yī)者研究通過(guò)生活方式干預(yù)與胰島素增敏劑(如二甲雙胍與TZD藥物)治療PCOS患者后，其能量代謝得以改善，同時(shí)卵巢排卵率也有一定程度的提高[5]。由此，學(xué)者們推測(cè)PCOS胰島素水平升高不僅是患者能量代謝紊亂的標(biāo)志信號(hào)，也是導(dǎo)致患者排卵障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6,7]。臨床上治療效果顯示，改善機(jī)體能量代謝、降低胰島素水平能夠在一定程度上提高PCOS的排卵生殖力，但作用十分有限，治療效果并不理想[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，下丘腦胰島素受體后IRS2/PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)受阻(即下丘腦胰島素抵抗)將導(dǎo)致機(jī)體胰島素分泌增加[9]。筆者擬通過(guò)硫酸普拉睪酮鈉誘導(dǎo)構(gòu)建PCOS大鼠模型，探究PCOS大鼠是否也存在下丘腦胰島素抵抗，以及改善下丘腦胰島素抵抗能否降低PCOS胰島素水平、促進(jìn)卵巢排卵，并研究PCOS大鼠下丘腦胰島素受體底物(IRSs)、PI3K、AKT2mRNA的影響，從而闡明下丘腦胰島素抵抗在多囊卵巢綜合征排卵障礙中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SD雌性大鼠為研究對(duì)象，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。50只大鼠均為3周齡，體重180～200g。

1.2 模型建立

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后， 頸背部皮下注射硫酸普拉睪酮鈉溶液，9mg/100g，連續(xù)注射20d。該組大鼠在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均給予高脂飼料喂養(yǎng)。計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivityindex, ISI)：

篩選造模組中ISI小于正常組ISI的均值減1.96標(biāo)準(zhǔn)差、且陰道涂片無(wú)周期變化者作為成模大鼠 ,即為造模成功[10]。正常組(24只)：頸背部皮下注射等量溶劑(共20d)，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)該組大鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.3 分組與給藥

選擇24只造模成功的SD大鼠，隨機(jī)分為2組：模型對(duì)照組(12只)不進(jìn)行任何給藥處理；模型激活組(12只)連續(xù)皮下注射1.1μg/kg胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)，8周。

將正常組大鼠24只，隨機(jī)分為2組：正常對(duì)照組(12只)不進(jìn)行任何給藥處理。抑制組(12只)大鼠每日腦室內(nèi)灌注0.7mg/kg的P13K阻滯劑渥曼青霉素(Wortmannin)和11.2mg/kg的AKT抑制劑哌立福辛(Perifosine)，連續(xù)8周[11]。

1.4 體重和胰島素及脂質(zhì)代謝測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠均禁食12h，然后采用0.3mL/100g的10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射以麻醉大鼠。腹主動(dòng)脈取血后，室溫下(25℃±2℃)靜置20min，然后4℃離心機(jī)中3500r/min離心10min。采用相應(yīng)試劑盒分別檢測(cè)血清中游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)和總膽固醇水平(TC)。

1.5 下丘腦中IRS-2含量測(cè)定[12]

上述大鼠頸椎脫臼處死后，于冰上剝?nèi)∠虑鹉X。采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，固定時(shí)間24h。然后采用手術(shù)刀將目的部位組織修整平，進(jìn)行乙醇梯度脫水后，采用石蠟進(jìn)行包埋并切片(4μm)，每個(gè)下丘腦隨機(jī)選取4張切片進(jìn)行IRS-2含量測(cè)定。60℃烘烤切片后，采用二甲胺和乙醇脫蠟至水。隨后組織切片采用EDTA抗原修復(fù)緩沖液(pH9.0)進(jìn)行微波爐抗原修復(fù)10min。自然冷卻后，采用PBS(pH7.4)洗滌3次，5min/次。

采用3%過(guò)氧化氫溶液阻斷組織中內(nèi)源性過(guò)氧化物酶(20min)后，分別加入一抗(1∶500，5%BSA)和HRP標(biāo)記的二抗，分別孵育過(guò)夜和50min。采用DAB顯色后Harris蘇木素復(fù)染3min，1%鹽酸酒精分化數(shù)秒后氨水返藍(lán)。最后采用乙醇梯度脫水后，采用中性樹膠封片。

切片200×拍照后，采用軟件Image-ProPlus6.0對(duì)照片分析，得出每張照片陽(yáng)性的積累光密度(IOD值)，代表IRS-2含量。

1.6 下丘腦中PI3K和p-PI3K蛋白表達(dá)的測(cè)定[13]

1.6.1 總蛋白的提取

取各大鼠下丘腦組織1mm3，采用冷TBS洗滌2～3次后，采用10倍體積的下丘腦組織試劑(含蛋白酶抑制劑：非磷酸化/磷酸化蛋白酶抑制劑)冰上勻漿。冰浴30min后，10000r/min離心5min。收集上清，即下丘腦組織總蛋白溶液，備用。

1.6.2 Western Blot測(cè)定下丘腦中PI3K和p-PI3K蛋白表達(dá)

采用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。測(cè)完蛋白含量后，計(jì)算含40μg蛋白的溶液體積即為SDS-PAGE電泳的上樣量。

轉(zhuǎn)膜后，分別使用5%脫脂牛奶(溶劑為0.5%TBST)和5%脫脂牛奶(溶劑為5%BSA)進(jìn)行非磷酸蛋白和磷酸化蛋白的檢測(cè)。一抗和二抗加入后，分別4℃過(guò)夜和室溫30min孵育。最后采用顯影和定影試劑進(jìn)行顯定影。拍照后，采用Alpha凝膠圖像分析軟件進(jìn)行目標(biāo)條帶的光密度值。

1.7 下丘腦中AKT2mRNA檢測(cè)表達(dá)

取100mg下丘腦組織，加入1mL Trizol Reagent進(jìn)行勻漿。然后加入250μL三氯甲烷，靜置后10000r/min離心10min(4℃)。取上清，加入0.8倍體積的異丙醇，-20℃靜置15min后，10000r/min離心10min(4℃)。棄去上清，采用1.5mL 75%乙醇洗滌后，吹干。反轉(zhuǎn)錄后，采用定量PCR測(cè)定AKT2基因的表達(dá)情況。

1.8 排卵生殖力檢測(cè)

摘取各組大鼠雙側(cè)卵巢，用4%多聚甲醛固定，采用石蠟包埋并切片后，HE染色，采用顯微鏡觀察。計(jì)算各組大鼠排卵率、平均排卵數(shù)和囊性擴(kuò)張卵泡率[14]:

(1)

(2)

(3)

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重和空腹血胰島素水平測(cè)定結(jié)果

大鼠體重測(cè)定結(jié)果匯總?cè)绫?所示。由表1可以看出，模型對(duì)照組即多囊卵巢綜合征大鼠，體重顯著性大于其他各組大鼠(P<0.05);抑制組即PI3K和AKT抑制組大鼠，相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)其體重顯著性高于正常對(duì)照組(P<0.05);模型激活組的體重顯著性低于模型對(duì)照組和抑制組(P<0.05)，但是明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。

表1 各組大鼠的體重

實(shí)驗(yàn)開始后每2周測(cè)定大鼠的空腹血胰島素水平，測(cè)定結(jié)果匯總?cè)绫?所示。由表2可以看出，正常對(duì)照組和模型激活組的大鼠空腹胰島素水平隨著時(shí)間推移并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);模型對(duì)照組即多囊卵巢綜合征大鼠，隨著時(shí)間推移，血胰島素水平升高(P<0.05)，且顯著高于其他各組大鼠(P<0.05);抑制組即PI3K和AKT抑制組大鼠，相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)其血胰島素顯著性高于正常對(duì)照組(P<0.05);模型激活組的血胰島素顯著性低于模型對(duì)照組和抑制組(P<0.05)，恢復(fù)到正常對(duì)照組血胰島素水平，與正常對(duì)照組并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組大鼠空腹胰島素水平

2.2 大鼠脂質(zhì)代謝水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠均禁食12h后取動(dòng)脈血測(cè)定脂質(zhì)代謝，測(cè)定結(jié)果匯總?cè)绫?所示。由表3可以看出，抑制組、模型對(duì)照組和模型激活組的大鼠TC、TG、FFA均高于正常對(duì)照組(P<0.05);模型對(duì)照組大鼠TC、TG、FFA則均高于抑制組和模型激活組(P<0.05);抑制組大鼠TC、TG、FFA均顯著性高于模型激活組(P<0.05)。

表3 各組大鼠的脂質(zhì)代謝檢測(cè)結(jié)果

2.3 大鼠下丘腦中IRS-2含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠下丘腦中IRS-2累積光密度值情況如下：正常對(duì)照組2802.76±225.88、抑制組1492.48±116.37、模型對(duì)照組277.55±633.14、模型激活組1736.49±185.49。抑制組、模型對(duì)照組和模型激活組的大鼠下丘腦中IRS-2均低于正常對(duì)照組(P<0.05)；模型對(duì)照組下丘腦中IRS-2低于抑制組和模型激活組(P<0.05)；抑制組大鼠下丘腦中IRS-2低于模型激活組(P<0.05)。

2.4 大鼠下丘腦中PI3K和p-PI3K蛋白表達(dá)的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠下丘腦中PI3K和p-PI3K相對(duì)于β-actin的表達(dá)量測(cè)定結(jié)果匯總?cè)绫?所示。由表4可以看出，抑制組、模型對(duì)照組和模型激活組的大鼠下丘腦中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin均低于正常對(duì)照組(P<0.05)；模型對(duì)照組大鼠下丘腦中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin低于抑制組和模型激活組(P<0.05)；抑制組大鼠下丘腦中PI3K/β-actin和p-PI3K/β-actin低于模型激活組(P<0.05)。

2.5 大鼠下丘腦中AKT2mRNA檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠下丘腦中AKT2mRNA測(cè)定結(jié)果匯總?cè)绫?所示。由表4可以看出，抑制組、模型對(duì)照組和模型激活組的大鼠下丘腦中AKT2mRNA均低于正常對(duì)照組(P<0.05)；模型對(duì)照組大鼠下丘腦中AKT2mRNA低于抑制組和模型激活組(P<0.05)；抑制組大鼠下丘腦中AKT2mRNA低于模型激活組(P<0.05)。

表4 各組大鼠下丘腦中PI3K、p-PI3K蛋白和AKT2mRNA表達(dá)

2.6 大鼠排卵生殖力

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠排卵生殖力測(cè)定結(jié)果匯總?cè)绫?所示。由表5可以看出，抑制組、模型對(duì)照組和模型激活組的大鼠平均排卵數(shù)和排卵率均低于正常對(duì)照組(P<0.05);模型對(duì)照組大鼠平均排卵數(shù)和排卵率低于抑制組和模型激活組(P<0.05);抑制組大鼠平均排卵數(shù)和排卵率低于模型激活組(P<0.05);抑制組、模型對(duì)照組和模型激活組的大鼠囊性擴(kuò)張卵泡率高于正常對(duì)照組(P<0.05);模型對(duì)照組大鼠囊性擴(kuò)張卵泡率高于抑制組和模型激活組(P<0.05);抑制組大鼠囊性擴(kuò)張卵泡率高于模型激活組(P<0.05)。

表5 各組大鼠排卵生殖力

3 討論

下丘腦PI3K是參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信號(hào)分子之一[15]。下丘腦PI3K催化亞基的正常表達(dá)可生成PIP2和PIP3，作用于PI3K信號(hào)通路下游的各種酶，保證了胰島素代謝功能的正常實(shí)現(xiàn)[16]。AKT是作為PI3K信號(hào)通路上重要的下游分子，參與實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體糖代謝調(diào)解過(guò)程[17]。胰島素受體底物(IRSs)是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受體后水平的重要信號(hào)蛋白。其中IRS-2參與胰島素在中樞下丘腦的傳遞過(guò)程，可以影響PI3K信號(hào)通路對(duì)胰島素的傳導(dǎo)[18]。筆者以SD雌性大鼠為研究對(duì)象，頸背部皮下注射硫酸普拉睪酮鈉溶液建立多囊卵巢綜合征大鼠模型。并分為正常對(duì)照組、抑制組(Wortmannin和Perifosine阻滯PI3K/AKT通路)、模型對(duì)照組和模型激活組(皮下注射1.10μg/kg胰島素一號(hào)增長(zhǎng)因子IGF-1)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組即多囊卵巢綜合征大鼠，體重、空腹胰島素水平、囊性擴(kuò)張卵泡率、血清中FFA、TG和TC均大于其他各組大鼠(P<0.05)；抑制組即PI3K/AKT通路抑制組大鼠，相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)其體重、空腹胰島素水平、囊性擴(kuò)張卵泡率、血清中FFA、TG和TC均高于正常對(duì)照組(P<0.05)；模型激活組的體重、空腹胰島素水平、囊性擴(kuò)張卵泡率、血清中FFA、TG和TC均低于模型對(duì)照組和抑制組(P<0.05)，但是高于正常對(duì)照組(P<0.05)；模型對(duì)照組即多囊卵巢綜合征大鼠，下丘腦中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表達(dá)水平、平均排卵數(shù)和排卵率均低于其他各組大鼠(P<0.05)；抑制組即PI3K/AKT通路抑制組大鼠，相同培養(yǎng)時(shí)間時(shí)下丘腦中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表達(dá)水平、平均排卵數(shù)和排卵率均低于正常對(duì)照組(P<0.05)；模型激活組的下丘腦中IRS-2、PI3K/β-actin、p-PI3K/β-actin、AKT2mRNA表達(dá)水平、平均排卵數(shù)和排卵率均高于模型對(duì)照組和抑制組(P<0.05)，但是低于正常對(duì)照組(P<0.05)。

單純下丘腦胰島素受體后IRS2/PI3K/AKT信號(hào)障礙可顯著減輕胰島素對(duì)肝糖輸出的抑制作用[19]。下丘腦胰島素受體后IRS2/PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)受阻(即下丘腦胰島素抵抗)將導(dǎo)致機(jī)體胰島素分泌增加，進(jìn)而引起大鼠下丘腦胰島素抵抗和排卵障礙[20]。對(duì)比多囊卵巢綜合征大鼠和IGF-1激活大鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)，可以看出多囊卵巢綜合征大鼠呈現(xiàn)典型的下丘腦胰島素抵抗和排卵障礙。

綜上所述，下丘腦胰島素受體IRS2/PI3K/AKT信號(hào)傳遞在升高對(duì)機(jī)體胰島素水平與降低排卵生殖力中的作用具有促進(jìn)作用。