UPLC測定不同方式干燥的猴頭菌中麥角甾醇的含量

寇曉涵 張 強 李洋洋 閆寶松 閻秀峰 鄭 健*

（1東北林業(yè)大學鹽堿地生物資源環(huán)境研究中心/東北鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040；2黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江牡丹江157011）

猴頭菌（Hericiumerinaceus）屬擔子菌綱，多孔菌目，齒菌科，猴頭屬，表面長滿具有肉質(zhì)感的長毛，子實體圓形而粗大，肉質(zhì)鮮嫩，味道香甜，鮮美可口。研究表明猴頭菌的營養(yǎng)及藥用價值很高，其中的麥角甾醇成分具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化[1]、抗病毒[2]、降血糖和免疫調(diào)節(jié)[3]等作用。麥角甾醇對抑制腫瘤生長具有非常顯著的療效，可通過抑制血管生長、激活抑癌基因發(fā)揮作用[4]，或者直接通過細胞毒性直接殺死腫瘤細胞[5]，并且麥角甾醇具有顯著的抑菌活性[6]，新抗菌劑可以用蘑菇來替代[7]，其他研究也表明麥角甾醇能夠增強免疫力[8]，具有免疫調(diào)節(jié)作用。除此之外，維生素D2的產(chǎn)生是通過紫外光照射麥角甾醇得到的，所以食用菌是天然的維生素D來源[9]。

筆者以猴頭菌麥角甾醇為研究對象，采用不同干燥方式對猴頭菌進行處理，使用超高效液相色譜檢測不同干燥方法對猴頭菌中麥角甾醇含量的影響。以往研究中使用高效液相色譜檢測麥角甾醇含量居多[10-13]，但是筆者使用了UPLC進行檢測，具有操作簡便、靈敏度高等特點，旨在為今后猴頭菌的質(zhì)量檢測和營養(yǎng)分析提供穩(wěn)定可靠的評估方法，為制藥和食品行業(yè)開發(fā)、應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與試劑

猴頭菌采購于黑龍江省海林市土砬子村菇棚，菌株為TC-2；甲醇和乙腈為色譜純，購自美國Sigma公司；乙醇為分析純，購自天津市富宇精細化工有限公司；麥角甾醇標準品（純度為95%），購自成都化夏化學試劑有限公司。

1.2 試驗儀器

WatersACQUITYUPLCBEH超高效液相色譜儀，2695紫外檢測器，Empower2色譜工作站（美國Waters公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；101-2AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；SorvallLegendMicro17型離心機（美國Thermo公司）；MCFD5-3型冷凍干燥機（美國GoldSIM公司）；QW-4HV型微波真空干燥箱（廣州科威微波能有限公司）；3510EDTH型超聲波清洗器（美國Branson公司）；Laborota4011型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）。

1.3 色譜條件

采用美國WatersACQUITYUPLCBEH超高效液相色譜儀，聯(lián)合2695紫外檢測器進行檢測；色譜柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流動相為乙腈；流速為0.3mL/min；檢測波長282nm，進樣體積4μL，室溫條件下檢測，運行時間為6min。

1.4 試驗方法

1.4.1 干燥方法

自然干燥：將猴頭菌置于陽光下自然晾干；

加熱干燥：將猴頭菌置于電熱鼓風干燥內(nèi)，分別以50℃、60℃和70℃加熱烘干；

真空冷凍干燥：將猴頭菌于-80℃低溫放置24h，然后置于真空冷凍干燥機內(nèi)凍干；

真空干燥：將猴頭菌置于真空干燥箱內(nèi)，設置真空干燥箱內(nèi)真空度為0.06MPa，溫度分別為50℃、60℃和70℃；

微波真空干燥：將猴頭菌置于微波真空干燥箱內(nèi)，分別在1.34kW、2.68kW和4.02kW下干燥。

干燥指標：在干燥皿內(nèi)放置2d，質(zhì)量變化不超過2mg為干燥指標。

1.4.2 標準曲線的繪制

精密稱取麥角甾醇標準品4.0mg，用無水乙醇溶解并定容至10mL的容量瓶中，得到濃度為400μg/mL的麥角甾醇母液，用無水乙醇依次稀釋，得到200、100、50、25、12.5和6.25μg/mL的標準溶液。將上述標準溶液加入到進樣瓶中，UPLC檢測。分別以麥角甾醇濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程。

1.4.3 猴頭菌樣品中麥角甾醇含量的測定

參照劉京晶等[14]的提取方法，精密稱取猴頭菌粉末0.10g加入到10mL離心管中，然后加入無水乙醇2mL，靜置過夜后14000×g離心10min，取上清液于新的離心管中。殘渣中加入無水乙醇2mL，90℃恒溫水浴30min，14000×g離心10min，合并兩次上清液，用無水乙醇定容至10mL，搖勻，0.45μm濾膜過濾，進行UPLC分析。

選擇不同提取溶劑（50%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇、50%甲醇溶液和甲醇）、不同水浴時間（15、30、45、60min）和不同料（g）液（mL）比（1∶20、1∶50、1∶100、1∶200）進行提取工藝的優(yōu)化。

1.4.4 方法驗證

選用最佳的提取條件，對猴頭菌樣品中麥角甾醇含量進行測定，并檢驗本方法的穩(wěn)定性、精密度、重復性和回收率。

1）穩(wěn)定性：取同一樣品溶液，按色譜檢測方法，分別在0h、1h、2h、4h、8h、12h測定樣品溶液中麥角甾醇的含量。

2）精密度：取同一樣品溶液，按色譜檢測方法，連續(xù)測6次。

3）重復性：取6份同一樣品溶液，按色譜檢測方法，測定樣品溶液中麥角甾醇的含量。

4）加樣回收率：精密吸取6份1mL已知濃度的猴頭菌試樣，其中三份直接用UPLC測定濃度，另外三份分別加入1mL同等濃度的標準品溶液，用UPLC測定其濃度，根據(jù)標準曲線方程計算樣品中麥角甾醇的含量，計算回收率。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均取三次數(shù)據(jù)的平均值，用平均值±標準差表示，采用MicrosoftExcel2007進行繪圖，運用SPSS17.0Duncan法進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 猴頭菌中麥角甾醇的UPLC色譜圖

在選定的色譜條件下，麥角甾醇對照品和供試品的峰型良好，保留時間為2.9min（圖1）。

圖1 麥角甾醇標準品（A）和供試品（B）的UPLC色譜圖

2.2 標準曲線的繪制

以麥角甾醇濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程Y=9609.4X+4955.6，R2=0.9998。標準曲線見圖2。

2.3 單因素試驗

2.3.1 提取溶劑對猴頭菌樣品中麥角甾醇提取含量的影響

將料（g）液（mL）比定為1∶50，水浴時間為30min，使用50%乙醇溶液、95%乙醇溶液、無水乙醇、50%甲醇溶液和甲醇作為提取溶劑，提取猴頭菌中的麥角甾醇，并進行UPLC檢測。結(jié)果如圖3。提取溶劑為無水乙醇時，猴頭菌中麥角甾醇的含量最高，為（3.25±0.09）mg/g，其次是提取溶劑為100%甲醇的猴頭菌樣品，麥角甾醇含量為（3.15±0.25）mg/g，兩者沒有顯著性差異，均顯著高于95%乙醇作為提取溶劑時提取的樣品。而50%乙醇和50%甲醇溶液提取的麥角甾醇的含量遠遠低于其他溶液，說明乙醇（或甲醇）的濃度越高，提取效果越好。由于甲醇的毒性較大，且價格昂貴，因而選用無水乙醇作為提取溶劑。

圖2 麥角甾醇標準曲線

圖3 提取溶劑對猴頭菌中麥角甾醇提取含量的影響（P＜0.05）

2.3.2 水浴時間對猴頭菌樣品中麥角甾醇提取含量的影響

將料（g）液（mL）比為1∶50，提取溶劑為無水乙醇，選取不同水浴時間（15min、30min、45min和60min）提取麥角甾醇，研究不同水浴時間對猴頭菌中麥角甾醇含量的影響。結(jié)果如圖4所示：在水浴時間為60min時，麥角甾醇含量最高，為（3.39±0.09）mg/g，其次是水浴時間為30min時，麥角甾醇含量為（3.35±0.34）mg/g，兩者之間沒有顯著差異性。為節(jié)省時間，選擇30min作為最佳水浴時間。

2.3.3 料液比對猴頭菌樣品中麥角甾醇提取含量的影響

將無水乙醇作為提取溶劑，水浴時間為30min，樣品分別以料液比按照1∶200、1∶100、1∶50、1∶20的比例進行提取，研究不同料液比對猴頭菌中麥角甾醇含量的影響，結(jié)果如圖5所示。料液比為1∶20時，提取得到的甾醇含量最高，為（3.78±0.11）mg/g，其次料液比為1∶200時，甾醇含量為（3.69±0.11）mg/g，兩者差異不顯著，然后依次是料液比1∶100和1∶50均顯著低于料液比為1∶20時提取得到的麥角甾醇含量。因而選用1∶20作為最佳料液比。

圖4 水浴時間對猴頭菌中麥角甾醇提取含量的影響（P＜0.05）

圖5 料液比對猴頭菌中麥角甾醇提取含量的影響（P＜0.05）

2.3.4 方法驗證

按照1.4.4的試驗方法，對本研究所采用的UPLC方法的穩(wěn)定性、精密度、重復性和加樣回收率進行評價，結(jié)果分別見表1和表2。

表1 穩(wěn)定性、精密度和重復性試驗結(jié)果

由表1可以得出，穩(wěn)定性試驗測得麥角甾醇色譜峰面積的RSD為9.92%，精密度試驗測得麥角甾醇色譜峰面積的RSD為1.58%，重復性試驗測得麥角甾醇色譜峰面積的RSD為2.25%。

表2 回收率試驗的結(jié)果

由表2可知，平均回收率為（100.70±0.67）%，RSD為0.66%。該方法靈敏度較高、準確可靠，可重復性較好，比較穩(wěn)定，適用于對猴頭菌樣品中麥角甾醇進行定量測定。

2.4 不同干燥方法處理的猴頭菌樣品中麥角甾醇的含量分析

按照上述得到的最佳的提取條件，提取不同干燥方式處理的猴頭菌樣品中的麥角甾醇，通過UPLC聯(lián)合紫外檢測器進行檢測，根據(jù)標準曲線得到麥角甾醇的含量。結(jié)果如圖6所示，不同干燥方式處理的猴頭菌樣品中麥角甾醇的含量為2.09～3.89mg/g，而且不同干燥方式之間麥角甾醇的含量差異顯著。其中，真空干燥處理的猴頭菌中麥角甾醇的含量較其他處理方式得到的猴頭菌中麥角甾醇的含量高。而在70℃真空干燥處理的猴頭菌中提取得到的麥角甾醇含量最高，為（3.89±0.37）mg/g，其次為60℃真空處理的猴頭菌樣品，麥角甾醇含量為（3.88±0.28）mg/g，兩者之間無顯著性差異。微波干燥處理的猴頭菌樣品提取得到的麥角甾醇含量最低，其中麥角甾醇含量最低的是1.34kW微波干燥下，為（2.09±0.10）mg/g。自然干燥、冷凍干燥和熱風干燥處理的猴頭菌樣品中麥角甾醇的含量沒有顯著差異。

圖6 不同方式干燥對猴頭菌樣品中麥角甾醇含量的影響（P＜0.05）

3 小結(jié)與討論

微波干燥和冷凍干燥會對猴頭菌樣品中麥角甾醇含量造成影響，經(jīng)微波干燥的樣品中麥角甾醇含量有所降低，魯文靜等[15]研究發(fā)現(xiàn)可能是由于微波干燥會導致麥角甾醇結(jié)構發(fā)生變化，使之分解成維生素D2，從而使麥角甾醇含量降低。理論上說，真空冷凍干燥能夠避免樣品中有效成分的分解。然而，筆者試驗結(jié)果表明，冷凍干燥處理的猴頭菌樣品中麥角甾醇的含量并沒有顯著高于其他處理方式得到的猴頭菌樣品中麥角甾醇的含量。這可能與冷凍干燥的技術和工藝有關，也有可能是冷凍干燥導致了樣品局部組織細胞水分快速散失，形成的空腔中的空氣并沒有隨之排出，且細胞組織中的酶沒有被滅活，從而導致樣品組織中有效成分降解[16]，因此真空冷凍干燥可能導致麥角甾醇含量降低。真空干燥處理的猴頭菌麥角甾醇的含量較其他處理方式得到的猴頭菌中麥角甾醇的含量高，且60℃和70℃真空干燥得到的猴頭菌樣品中麥角甾醇的含量最高。因此，為了提高猴頭菌中麥角甾醇的含量，可以優(yōu)先采用真空加熱的方式干燥猴頭菌樣品。同時，基于猴頭菌中麥角甾醇在慢性胃炎方面的顯著療效，猴頭菌在食品和醫(yī)療行業(yè)中具有重要作用，因而研究也為猴頭菌的干燥處理方式優(yōu)化提供了一定理論依據(jù)。