響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助提取金耳多糖的研究

蔣 益 鄭惠華 劉廣建 薛 璟* 季宏更 張蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

金耳（Tremellaaurantialba）又稱腦耳、黃木耳等，隸屬銀耳科、銀耳屬，為我國特有的一種珍稀食藥用菌[1]。金耳膠質(zhì)細膩，清潤可口，中醫(yī)認為其有化痰、止咳、定喘、調(diào)氣、平肝陽之功效[2]。金耳多糖是金耳的主要活性成分之一，研究證實金耳多糖具有調(diào)節(jié)機體免疫能力、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、抗輻射等多種藥理活性[2]。金耳菌種為復合菌種，金耳多糖按提取來源不同分為子實體多糖、菌絲體多糖、發(fā)酵液胞外多糖和酵母狀分生孢子多糖。在潮濕條件下，金耳成熟的擔孢子容易類似酵母菌那樣以芽殖方式產(chǎn)生大量酵母狀的分生孢子，這種分生孢子能以芽殖的方式不斷增殖[3]，因而可以利用金耳酵母狀分生孢子發(fā)酵生產(chǎn)多糖。在適宜條件下得到恒定的多糖成分，且具有周期短、成本低、不受季節(jié)的影響、可大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。因此，以液體發(fā)酵金耳分生孢子提取多糖具有廣泛地開發(fā)應(yīng)用前景和科學意義。

目前食藥用菌多糖的提取方式主要有水提醇沉法、酸堿浸提法、酶法、超聲波法、微波法和超臨界流體萃取法等。單純用水浸提時間長，效率低[4]；酸堿提取易引起糖降解及糖甘鍵斷裂，從而破壞多糖活性結(jié)構(gòu)[5]。水解酶的價格高、易失活，在生產(chǎn)上應(yīng)用困難[6]。超聲波法是利用超聲波的空化效應(yīng)增加溶劑穿透力，提高細胞內(nèi)組分的溶出速度和溶出次數(shù)；該法既可以在常溫下較溫和地將食藥用菌細胞分解、保持細胞組分的生物活性，又可較大幅度提高多糖等有效成分的提取率[7]。近年來，超聲波輔助提取技術(shù)在多糖提取工藝領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，其中，在蟲草花多糖[8]、銀耳多糖[9]、猴頭菇多糖[10]、楊樹口蘑多糖[11]等食藥用菌多糖的提取中成功應(yīng)用。

因此，筆者以液體發(fā)酵金耳酵母狀孢子及其發(fā)酵液為材料，采用超聲波輔助熱水浸提法提取金耳多糖，在單因素試驗的基礎(chǔ)之上，運用響應(yīng)面統(tǒng)計分析軟件優(yōu)化多糖提取工藝，以期為金耳多糖的進一步開發(fā)利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

（1）供試金耳菌株菌株：金耳酵母狀分生孢子菌株TAY6048，由江蘇省蘇微微生物研究有限公司提供，改良PDA培養(yǎng)基4℃保存。

（2）培養(yǎng)基：改良PDA培養(yǎng)基為馬鈴薯200g煮汁，葡 萄 糖20g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加 水1000mL，瓊脂粉20g，pH自然。金耳種子培養(yǎng)基：蔗 糖10g，葡 萄 糖20g，酵 母 膏2g，蛋 白 胨2g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加水1000mL，pH自然。發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉30g，豆餅粉10g，蔗糖5g，KH2PO41g，MgSO40.5g，加水1000mL，pH自然。

（3）主要設(shè)備：PL203型電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SG78型數(shù)字pH計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GKC214恒溫水浴鍋，上海蘇達實驗儀器有限公司；JB90-D攪拌器，上海標本模型廠；TDL-40B臺式低速離心機，上海安亭科學儀器廠；TS-2102型雙層恒溫搖床，上海夢藍儀器設(shè)備有限公司；DHG-9245A型恒溫鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；JY98-ⅢDN超聲波細胞粉碎機，寧波新藝超聲設(shè)備有限公司；721分光光度計，上海光學儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 液體發(fā)酵

將活化好的斜面菌種接種于金耳種子培養(yǎng)基中，25℃，150r/min振蕩培養(yǎng)3d后以5%的接種量轉(zhuǎn)接500mL發(fā)酵瓶，每瓶液體量為100mL，25℃、150r/min振蕩培養(yǎng)4d。

1.2.2 多糖提取與制備

按照試驗設(shè)計的超聲條件提取，然后在90℃水浴下浸提4h，8000r/min離心10min，取上清液，濃縮至原體積1/5，加入4倍體積的無水乙醇，充分混勻后置于4℃冰箱過夜。第2天取出8000r/min離心10min，棄上清，收集沉淀，凍干即為粗多糖。稱取質(zhì)量，硫酸-蒽酮法[12]測沉淀多糖含量。此多糖為胞外多糖和胞內(nèi)多糖之和，將其換算為單位發(fā)酵體積的多糖提取量（g/L）。

1.2.3 金耳多糖提取單因素試驗

以單位發(fā)酵體積金耳多糖提取量為指標，分別考察超聲功率、超聲時間、超聲溫度對金耳多糖提取量的影響。每組試驗重復3次。

1.2.3.1 超聲功率

設(shè)定超聲時間15min，超聲溫度40℃，設(shè)定超聲功率200、300、400、500、600、700W，考察不同超聲功率對金耳單位發(fā)酵體積多糖提取量的影響。

1.2.3.2 超聲時間

設(shè)定超聲功率500W，超聲溫度40℃，分別設(shè)定不同的時間5、10、15、20、25、30min提取，考察不同超聲時間對金耳單位發(fā)酵體積多糖提取量的影響。

1.2.3.3 超聲溫度

設(shè)定超聲功率500W，超聲時間15min，設(shè)定溫度分別為35、40、45、50、55、60℃，考察不同超聲溫度對金耳單位發(fā)酵體積多糖提取量的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以單位發(fā)酵體積金耳多糖提取量為響應(yīng)值，以超聲功率（A）、超聲時間（B）和超聲溫度（C）為試驗因素，設(shè)計三因素三水平的Box-Benhnken中心組合試驗（表1），對金耳多糖超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel進行整理和繪圖；同時利用Design-Expert8.0統(tǒng)計分析軟件進行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，運用該軟件中響應(yīng)面值優(yōu)化程序求得當響應(yīng)面值最大時各因素的最佳組合。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 超聲功率對金耳多糖提取量的影響

由圖1可以看出，在其他條件相同的情況下，當超聲功率為200W時，多糖提取量比較低；當超聲功率超過200W低于500W區(qū)間內(nèi)，多糖提取量隨著超聲功率的增加而提高；當超聲功率超過600W多糖提取量下降明顯。因此選擇350W、450W、550W作為中心組合試驗的三個水平。

圖1 超聲功率對金耳多糖提取量的影響

圖2 超聲時間對金耳多糖提取量的影響

2.1.2 超聲時間對金耳多糖提取量的影響

由圖2可以看出，在其他提取條件相同的情況下，超聲時間在5～20min內(nèi)，多糖提取量隨著超聲時間的延長，逐漸增加，超過20min，隨著超聲時間的延長，多糖提取量緩慢下降。原因可能是在試驗條件下隨著時間延長溶液溫度會升高，過長的超聲時間使得粗多糖中的糖蛋白組分緩慢變性析出，后期的高速離心使糖蛋白以不溶的沉淀狀物質(zhì)分離出來；另外，隨超聲時間的延長可能還會造成多糖的逐漸降解。因此，選擇超聲時間10、15、25min作為中心組合試驗的三個水平。

2.1.3 超聲溫度對金耳多糖提取量的影響

由圖3可以看出，在其他提取條件相同的情況下，隨著超聲溫度地提高，多糖提取量上升迅速，溫度45℃時，達到最高值，之后隨著提取溫度的上升，多糖提取量下降，當溫度超過50℃時，降速加快。一般來說，溶液溫度的升高，會增加溶劑分子和溶質(zhì)分子的運動，促進擴散作用，從而有利于提高多糖提取率，但是溫度過高有可能破壞有效成分，降低多糖活性，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的析出也將增加，會對后續(xù)處理帶來不便。因此，選擇超聲溫度40、45、50℃作為中心組合試驗的三個水平。

圖3 超聲溫度對金耳多糖提取量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計原理，以超聲功率、超聲時間、超聲溫度3個因素為自變量，以金耳單位發(fā)酵體積多糖提取量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進行三因素三水平的試驗設(shè)計，共包括17組試驗方案，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

2.2.2 模型建立與方差分析

利用設(shè)計軟件Design-Expert對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得超聲功率（A）、超聲時間（B）、超聲溫度（C）的二次多項回歸方程：

Y=2.86+0.033A+0.011B+0.079C+0.012AB++0.023AC+0.015BC-0.17A2-0.062B2-0.082C2，此回歸模型方程的ANOVA分析結(jié)果見表3。

由表3可以看出，回歸模型的P值小于0.0001，說明該二次回歸模型是極顯著的；失擬項P為0.1341，P大于0.05，差異不顯著，未知因素對試驗結(jié)果干擾小，說明殘差均由隨機誤差引起；由F值可以看出3個因素對金耳多糖提取的影響程度由大到小依次為超聲溫度（C）＞超聲功率（A）＞超聲時間（B）。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗回歸模型方差分析

同時，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9925，表明有99.25%的數(shù)據(jù)可用此方程來解釋，能夠較好地反應(yīng)金耳多糖提取的變化；模型的調(diào)整相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.9828，說明擬合模型方程可靠，有很高的可信度。綜上所述，該二次回歸模型擬合程度好，試驗誤差較小，可用該模型方程對金耳多糖提取條件進行預測和分析。

2.2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸模型，利用Design-Expert8.0.6軟件繪制響應(yīng)面分析圖和等高線圖（圖4），從響應(yīng)面分析圖中可以看出各因素交互作用對金耳多糖提取的影響。對金耳多糖提取量影響越大的因素，其曲線走勢會相對越陡。在等高線圖中，各因素對金耳多糖提取的影響體現(xiàn)在其軸向等高線的密集程度上，軸向等高線越密集，說明該因素對金耳多糖提取的影響越顯著。通過比較圖4中響應(yīng)面分析圖和等高線圖可以看出：超聲時間（B）與超聲溫度（C）兩因素之間的交互作用對金耳多糖提取的影響較為顯著，而其他因素兩兩之間的交互作用對金耳多糖提取的影響較小。

圖4 各兩因素交互作用對金耳多糖提取影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

2.2.4 最佳條件的確定及驗證

通過Design-Expert8.0.6軟件分析得到超聲波輔助提取金耳多糖的最佳工藝條件，即超聲功率518W、超聲時間16min、超聲溫度50℃，此條件下多糖單位發(fā)酵體積提取量為2.85g/L，模型預測值為2.88g/L，模型預測值與實測值相比，相對誤差為1.05%。說明試驗建立的二次多項回歸方程能夠有效地反應(yīng)各因素對金耳多糖提取的影響，用響應(yīng)面法優(yōu)化回歸方程模型可行，具有實際可操作性。

3 結(jié)論

響應(yīng)曲面法，采用了合理的試驗設(shè)計，能以很少的試驗數(shù)量和時間對試驗進行全面研究，從而快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，并擬合出相應(yīng)模型，近年來被廣泛應(yīng)用于眾多生產(chǎn)加工條件的優(yōu)化控制[13]。諸多研究表明，超聲波功率、超聲溫度、超聲時間是多糖類物質(zhì)提取的主要影響因素。通過響應(yīng)面分析，獲得金耳多糖超聲波輔助提取的最佳條件為：超聲功率518W、超聲時間16min、超聲溫度50℃。在此優(yōu)化條件下，進行3次重復驗證試驗的平均多糖提取量為2.85g/L，與預測值誤差較小，說明經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后的試驗條件具有實際意義；同時，也表明該模型設(shè)計合理，對金耳多糖的最佳提取工藝具有現(xiàn)實指導作用。