云南省蒙自酸性礦山排水微生物群落結(jié)構(gòu)和功能

梁宗林，秦亞玲，王沛，王保軍，劉征華，尹華群，劉雙江,3，姜成英,3

研究報(bào)告

姜成英 中國科學(xué)院微生物研究所研究員。2001年于中國科學(xué)院過程工程研究所獲博士學(xué)位。2006年6–9月和2008年1月–2009年1月，國家留學(xué)基金委選派德國波鴻魯爾大學(xué)訪問學(xué)者；2018年3–5月，美國東卡羅萊納大學(xué)高級(jí)訪問學(xué)者。長期從事有機(jī)污染物的微生物降解和趨化機(jī)理及污染環(huán)境和特殊環(huán)境中微生物種群多樣性和功能多樣性研究；進(jìn)行極端嗜酸熱古菌和嗜酸細(xì)菌鐵、硫代謝調(diào)控機(jī)制及環(huán)境適應(yīng)機(jī)制以及生物冶金技術(shù)及礦山污染環(huán)境修復(fù)治理應(yīng)用基礎(chǔ)的研究，發(fā)現(xiàn)了嗜酸微生物硫代謝新途徑，解析了其環(huán)境適應(yīng)機(jī)制。在國內(nèi)外重要學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表相關(guān)研究論文50多篇。

云南省蒙自酸性礦山排水微生物群落結(jié)構(gòu)和功能

梁宗林1,2，秦亞玲1,2，王沛1,2，王保軍1，劉征華4,5，尹華群4,5，劉雙江1,2,3，姜成英1,2,3

1中國科學(xué)院微生物研究所 微生物資源前期開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 2中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049 3中國科學(xué)院環(huán)境微生物技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，北京 100101 4中南大學(xué) 資源加工與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410083 5中南大學(xué) 教育部生物冶金重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410083

為探究酸性礦山排水生態(tài)系統(tǒng)不同環(huán)境中的微生物群落和功能，全面了解酸性礦山排水的形成和發(fā)展規(guī)律，采用高通量測(cè)序技術(shù)研究云南省蒙自某礦區(qū)酸礦水坑和周邊溪水中的原核微生物群落組成，并結(jié)合樣本理化特征分析影響群落結(jié)構(gòu)的主要因素，進(jìn)而解析菌群的環(huán)境功能。研究發(fā)現(xiàn)酸礦水坑中主要有廣古菌門、變形菌門 (包括α、γ和δ變形菌綱)、硝化螺菌門、厚壁菌門、放線菌門和酸桿菌門等類群，與周邊溪水的群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異。群落多樣性與pH呈顯著正相關(guān)，而熱原體綱 (Thermoplasmata) 與pH呈負(fù)相關(guān)，可對(duì)群落結(jié)構(gòu)起主導(dǎo)作用。酸礦水坑不同樣本中均具有高豐度的亞鐵原體屬(6.60%–86.34%)，酸硫桿菌屬是酸礦水和沉積泥中主要的鐵、硫氧化細(xì)菌，而專性鐵氧化的鉤端螺旋菌屬的豐度較低，鐵卵形菌屬幾乎只存在于酸礦水中；此外，嗜酸或耐酸的異養(yǎng)菌廣泛分布于酸礦水和沉積泥中，它們可促進(jìn)鐵、硫氧化菌的生長及催化礦石溶解。結(jié)果表明，pH通過影響微生物多樣性和菌群分布而對(duì)酸性礦山排水環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)造成重大影響。

酸性礦山排水，高通量測(cè)序，微生物多樣性，群落結(jié)構(gòu)，嗜酸菌

酸性礦山排水 (Acid mine drainage, AMD) 是礦區(qū)內(nèi)常見的一種極端環(huán)境，由黃鐵礦 (FeS2) 等硫化礦物在接觸空氣和水的條件下自發(fā)氧化及在微生物的參與下加速氧化溶解形成[1]，通常呈紅棕色或褐色，也稱為酸性礦山廢水，是礦山廢水中污染范圍最廣且危害最為嚴(yán)重的一類[2]。其典型特征是隨著氧化反應(yīng)的進(jìn)行，pH逐漸降低，通常為2–4，甚至小于2；具有高濃度的SO42?，以及鐵、鋁、銅、鉛、砷等金屬和類金屬元素。由于廢礦石和尾礦的大量積累，以及舊礦井的廢棄，酸性礦山排水的產(chǎn)生已成為一個(gè)全球性的環(huán)境問題[3]。

黃鐵礦是地球中含量最為豐富的硫化礦物[4]，它的氧化性溶解是酸性礦山排水的主要成因[5]，習(xí)慣性概括為總反應(yīng)式：4FeS2+14H2O+15O2→ 4Fe(OH)3+8SO42?+16H+。值得注意的是，黃鐵礦是酸不溶性礦物，其氧化性溶解包含一系列反應(yīng)過程[1]，F(xiàn)e3+起主要的氧化作用。黃鐵礦與水和氧氣接觸后發(fā)生氧化，產(chǎn)生Fe2+，并進(jìn)一步被氧化為Fe3+；在pH低于4時(shí)，F(xiàn)e2+自發(fā)氧化速度慢，它的氧化主要由嗜酸性鐵氧化菌完成[4]，且其速度超過自發(fā)氧化106倍，使Fe3+快速再生，這是促進(jìn)硫化礦物氧化的關(guān)鍵步驟[6]。另外，硫化礦物氧化還生成還原型無機(jī)硫化合物和S0，為硫氧化菌的生長提供能源物質(zhì)[7]。研究表明，酸性礦山排水自然條件嚴(yán)苛且地球化學(xué)因素相對(duì)簡單，但具有豐富的嗜酸性鐵、硫氧化及異養(yǎng)的細(xì)菌和古菌[8-9]。因此酸性礦山排水中的微生物及其鐵、硫元素代謝一直備受關(guān)注[10-11]。近些年來，不依賴于培養(yǎng)的微生物群落分析方法如16S rRNA基因克隆文庫、擴(kuò)增子測(cè)序、宏基因組測(cè)序以及宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)等已廣泛用于酸性礦山排水的研究[12-14]，使人們對(duì)其中的微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)和功能以及微生物與環(huán)境的相互作用有了更全面的認(rèn)識(shí)[15-16]。

酸性礦山排水生態(tài)系統(tǒng)包含酸礦水、沉積泥和生物膜等不同環(huán)境[13,17]，而目前關(guān)于其不同環(huán)境中微生物群落組成、分布及功能的研究依然較少[17]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)分析了云南省蒙自某礦區(qū)酸礦水坑不同類型樣本和周邊溪水的原核微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)差異，探究了影響群落結(jié)構(gòu)的主要因素，進(jìn)而分析了菌群的分布和適應(yīng)性及重要功能，旨在更全面地了解酸性礦山排水的形成和發(fā)展規(guī)律及其中的鐵、硫等元素生物地球化學(xué)循環(huán)[18]，發(fā)掘極端環(huán)境的微生物資源，同時(shí)為酸性礦山排水的治理和修復(fù)[4]以及微生物浸礦[19]提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 采樣地點(diǎn)描述和樣本采集

中國云南省蒙自市礦產(chǎn)資源豐富，其中白牛廠銀多金屬礦床已探明銀、鋅儲(chǔ)量達(dá)超大型規(guī)模，鉛、錫儲(chǔ)量達(dá)大型規(guī)模[20]。本研究于2017年9月22日采集該礦區(qū)內(nèi)某地點(diǎn) (東經(jīng)103°46′47″，北緯23°28′53″，海拔約1 847 m) 自然形成的酸礦水坑中酸礦水 (Drainage)、沉積泥 (Sediment) 和生物膜 (Biofilm) 等不同環(huán)境的樣本，并根據(jù)pH高低將各酸礦水坑分為B、C、D區(qū)。B區(qū)采集3個(gè)酸礦水樣本 (BD) 和5個(gè)沉積泥樣本 (BS)，C、D區(qū)各采集3個(gè)酸礦水樣本 (CD和DD) 和3個(gè)沉積泥樣本 (CS和DS)，E區(qū)采集3個(gè)生物膜樣本 (EF)。酸礦水坑周邊一處酸性水流 (Rill) 作為A區(qū)，采集3個(gè)周邊溪水樣本 (AR)。

1.2 理化參數(shù)測(cè)定

采用便攜式水質(zhì)多參數(shù)測(cè)量儀 (Star A329, Orion, USA) 測(cè)定采樣點(diǎn)的溫度、pH和電導(dǎo)率等參數(shù)?；卩彿茊止夤舛确?(HJ/T 345-2007) 和比濁法[21]，采用便攜式比色計(jì) (DR/890, HACH, USA) 測(cè)定酸礦水樣本的Fe2+、Fe3+和SO42?濃度。取適量樣本經(jīng)微波消解儀 (TOPwave, Analytik Jena, Germany) 消解及電熱板加熱趕酸后稀釋到適宜濃度，采用ICP-OES (Optima 5300 DV, PerkinElmer, USA) 測(cè)定元素含量[22]。

1.3 樣本基因組提取

采用DNA提取試劑盒 (PowerMax Soil DNA Isolation Kit, Qiagen) 提取樣本DNA。采用溶劑過濾器和真空泵將酸礦水抽濾通過微孔濾膜 (PES, Φ47–50 mm 0.22 μm, PALL) 以收集樣本中的微生物，用無菌手術(shù)剪和鑷子將濾膜剪碎[23]后進(jìn)行DNA提取。沉積泥和生物膜樣本直接按照試劑盒操作說明進(jìn)行提取。DNA溶解于Tris鹽酸緩沖液 (pH 8.0)中，?20 ℃凍存，由北京博奧匯玖生物科技有限公司完成16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序

選擇16S rRNA基因的V4–V5區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增子測(cè)序。取DNA樣品與已融合樣本標(biāo)簽 (Barcodes) 的引物515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′) 和926R (5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′) 于預(yù)混液 (HiFi HotStart ReadyMix, KAPA) 中配制PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 3 min；98 ℃變性20 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸1 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳和回收純化后采用Qubit測(cè)定DNA濃度并連接測(cè)序接頭完成文庫構(gòu)建。采用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)文庫片段長度分布和濃度，選擇Illumina MiSeq PE250平臺(tái)完成 測(cè)序。

1.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

序列數(shù)據(jù)不含測(cè)序接頭，根據(jù)樣本標(biāo)簽進(jìn)行分樣得到各樣本上、下游單端序列。采用USEARCH v11[24]合并單端序列，并用Cutadapt v2.3[25]去除引物；濾除低質(zhì)量序列和Singletons，并對(duì)高質(zhì)量序列進(jìn)行去冗余；按照97%相似性聚類 (Cluster) 形成可操作分類單元 (Operational taxonomic units，OTUs)[26]以及通過去噪 (Denoise) 保留數(shù)目大于6的序列獲得擴(kuò)增子序列變體 (Amplicon sequence variants，ASVs)[27]，去除嵌合體，OTUs和ASVs統(tǒng)稱為特征 (Features)；最終獲得各特征的代表序列并生成特征表。在QIIME2[28]中基于引物對(duì)515F/926R和Silva 132 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫訓(xùn)練RDP物種分類器[29]，并按照0.7置信度閾值進(jìn)行物種注釋；根據(jù)注釋結(jié)果去除線粒體和葉綠體序列并過濾特征表；基于樣本最少序列數(shù)對(duì)特征表抽平后計(jì)算各樣本α多樣性指數(shù)和距離矩陣。采用R語言及“vegan”、“ggplot2”、“ComplexHeatmap”等R程序包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及數(shù)據(jù)可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本理化特征

周邊溪水與酸礦水坑的物理化學(xué)特征差異明顯。各采樣區(qū)溫度均約為25 ℃，A區(qū)pH為5.07±0.15，在各區(qū)中最高；B、C、D區(qū)pH逐漸降低且同區(qū)酸礦水pH略高于沉積泥 (表1)；E區(qū)酸礦水坑采集到少量生物膜樣本，pH為1.52±0.08。

酸礦水坑中含量最豐富的元素是Fe，沉積泥中還含有大量的Al、S、K、Mg、Ca、P、As、Cu、Pb等元素。隨著pH的降低，酸礦水中Fe2+、Fe3+和SO42?的濃度，以及各元素 (除Mo和Se) 的含量明顯升高 (表1)。D區(qū)酸礦水中總Fe離子濃度高達(dá)(65 250±2 198) mg/L，同時(shí)含有高濃度的SO42?((134 000±2 000) mg/L) 和有毒的類金屬元素As ((641.7±8.8) mg/L)。如不及時(shí)加以控制，持續(xù)產(chǎn)生的酸性礦山排水將嚴(yán)重污染周圍的水體與土壤。

2.2 酸性礦山排水環(huán)境微生物群落多樣性

DD組樣本由于條件極端未提取到DNA，其他7組23個(gè)樣本經(jīng)測(cè)序共獲得1 300 684條有效序列，通過聚類和去噪及去除線粒體和葉綠體等特征后共獲得968個(gè)OTUs和801個(gè)ASVs (表2)。比較發(fā)現(xiàn)，B、C、D區(qū)各組ASVs數(shù)明顯高于OTUs數(shù)，表明酸礦水和沉積泥中具有較多序列相似性較高的16S rRNA基因，可能存在較多系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系較近的物種，最近已研究采用去噪形成ASVs的方法分析酸性礦山排水中的微生物群落[30]，因此本研究選擇去噪的結(jié)果用于后續(xù)分析。

各樣本的Alpha多樣性指數(shù)見表2。Observed指實(shí)際測(cè)到的特征數(shù)；Evenness為辛普森 (Simpson) 均勻度指數(shù)；香農(nóng) (Shannon) 指數(shù)同時(shí)衡量豐富度和均勻度，反映群落多樣性情況；PD表示Faith[31]提出的譜系多樣性 (Phylogenetic diversity)。各樣本覆蓋度 (Coverage) 均高于99%，表明測(cè)序深度足夠。AR群落豐富度 (ACE和Chao1) 最高，但均勻度較低；B、C、D區(qū)多樣性逐漸降低；EF豐富度較高，但均勻度最低?？傮w來看，pH更低的采樣區(qū)表現(xiàn)為群落多樣性更低，而生物膜具有一定的特殊性。

表1 各組樣本的物理化學(xué)參數(shù)(除AR和EF,±s)

Cond.: conductivity; TDS: total dissolved solids; NA: not available.

2.3 酸性礦山排水環(huán)境微生物群落組成

7組樣本共注釋到26個(gè)門、45個(gè)綱和96個(gè)目，通過堆疊柱形圖展示平均相對(duì)豐度前20的微生物類群。在門水平 (圖1A) 上，AR中變形菌門 (Proteobacteria) (66.58%) 和擬桿菌門 (Bacteroidetes) (31.41%) 占主要優(yōu)勢(shì)，屬于豐富類群 (平均相對(duì)豐度≥1%)；其次為芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes) (0.92%) 和藍(lán)細(xì)菌門 (Cyanobacteria) (0.38%)，但這兩個(gè)門屬于低豐度稀有類群 (平均相對(duì)豐度<1%)。BD中變形菌門 (63.98%) 的豐度最高；廣古菌門 (Euryarchaeota) (17.28%)、硝化螺菌門 (Nitrospirae) (11.82%)、酸桿菌門 (Acidobacteria) (4.00%) 和未分類的古菌 (Unclassified Archaea) (1.34%) 成為豐富類群；厚壁菌門 (Firmicutes) (0.61%)、浮霉?fàn)罹T (Planctomycetes) (0.50%)、放線菌門 (Actinobacteria) (0.35%)、Dependentiae (0.06%) 和Diapherotrites (0.03%) 的豐度增高。BS中廣古菌門 (50.12%) 的豐度明顯更高，在環(huán)境中占主導(dǎo)地位 (平均相對(duì)豐度≥50%)，未分類古菌(14.49%)、硝化螺菌門 (12.52%)、放線菌門 (3.04%)、Diapherotrites (0.74%) 和綠彎菌門 (Chloroflexi) (0.48%) 相比于其他組中豐度最高。與B區(qū)相比，CD中廣古菌門 (65.51%) 和Diapherotrites (0.45%) 的豐度更高；隨著酸礦水酸度和離子濃度的升高，CS和DS中廣古菌門的豐度逐漸升高，分別為55.76%和86.40%。生物膜EF中，廣古菌門的豐度高達(dá)96.40%，其他門為稀有類群。

在綱和目水平 (圖1B–C) 上，酸礦水坑樣本中熱原體綱 (Thermoplasmata) 熱原體目 (Thermoplasmatales) 豐度最高且分布最廣，其次為γ變形菌綱 (Gammaproteobacteria) 酸硫桿菌目 (Acidithiobacillales) 和未定位的類群；而γ變形菌綱中的β變形菌目 (Betaproteobacteriales) 和未培養(yǎng)的類群，以及α變形菌綱 (Alphaproteobacteria) 和擬桿菌綱 (Bacteroidia) 則主要存在于周邊溪水AR中。硝化螺菌門中只檢測(cè)到硝化螺菌綱 (Nitrospira) 的硝化螺菌目 (Nitrospirales)，主要存在于BD（11.82%）和BS（12.52%）中。α變形菌綱醋桿菌目 (Acetobacterales) 和酸桿菌綱 (Acidobacteriia) 酸桿菌目 (Acidobacteriales) 主要分布于BD (17.72%和4.00%) 中。梭菌綱 (Clostridia)梭菌目 (Clostridiales) 在酸礦水坑各組中保持較低豐度 (0.29%–1.95%)。酸微菌綱 (Acidimicrobiia) 中未培養(yǎng)的類群和酸微菌目 (Acidimicrobiales) 主要分布于BS (1.82%和1.10%) 中。δ變形菌綱 (Deltaproteobacteria) 的Sva0485[32]和微古菌綱 (Micrarchaeia) 的ARMAN-2主要位于BS (4.30%和0.72%) 和CD (2.26%和0.45%) 中。

表2 各樣本聚類和去噪的結(jié)果及α多樣性指數(shù)

圖1 酸性礦山排水環(huán)境微生物類群在不同分類水平上的相對(duì)豐度

2.4 酸性礦山排水環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)差異

基于Bray-Curtis相異和Jaccard相似距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析 (Principal coordinates analysis, PCoA)，結(jié)果表明，考慮群落組成豐度 (圖2A) 時(shí)，各組群落結(jié)構(gòu)間存在明顯差異；而不考慮豐度(圖2B)時(shí)，相同采樣區(qū)的酸礦水和沉積泥間差異明顯減小。進(jìn)一步基于Bray-Curtis距離作PERMANOVA檢驗(yàn)，結(jié)果同樣表明，各組群落結(jié)構(gòu)存在極顯著差異 (2=0.973,=0.001)，酸礦水和沉積泥間均具有明顯或顯著差異 (表3)。以上結(jié)果說明，各采樣區(qū)和樣本類型的群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，同區(qū)酸礦水和沉積泥的群落結(jié)構(gòu)差異主要受豐度的影響。層次聚類 (圖3) 直觀地展示各樣本群落結(jié)構(gòu)的相似程度，可見周邊溪水和生物膜明顯區(qū)別于其他組；同區(qū)酸礦水和沉積泥較為相似；C區(qū)與D區(qū)樣本更相似。

2.5 酸性礦山排水環(huán)境微生物群落對(duì)環(huán)境變量的響應(yīng)

對(duì)各樣本pH和Shannon指數(shù)進(jìn)行線性回歸分析 (圖4)，同時(shí)計(jì)算皮爾遜 (Pearson) 相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，pH和Shannon指數(shù)呈極顯著正相關(guān) (=0.804,≤0.001)，表明群落多樣性隨pH降低而降低。

進(jìn)一步以綱水平 (γ變形菌綱以目水平) 群落組成及豐度進(jìn)行冗余分析 (Redundancy analysis, RDA)，紅色劃線表示平均相對(duì)豐度 (>0.05%) 前20的微生物類群 (圖5)。RDA1和RDA2軸的解釋率分別為54.55% (≤0.05) 和19.97% (≤0.05)，表明群落結(jié)構(gòu)主要趨勢(shì)已被pH (≤0.05) 和樣本類型 (≤0.05) 解釋，pH及周邊溪水和生物膜對(duì)群落結(jié)構(gòu)具有重大影響。包括α變形菌綱、擬桿菌綱、熱原體綱、梭菌綱、β變形菌目和γ變形菌綱未培養(yǎng)的類群在內(nèi)的6個(gè)微生物類群對(duì)第一軸有重要貢獻(xiàn)，熱原體綱只與梭菌綱呈正相關(guān)；其余14個(gè)類群則對(duì)第二軸有主要的貢獻(xiàn)，之間多呈正相關(guān)。

圖2 基于Bray-Curtis相異和Jaccard相似距離矩陣的主坐標(biāo)分析(PCoA)

圖3 基于非加權(quán)組平均法 (UPGMA) 和Bray-Curtis距離矩陣對(duì)各樣本群落結(jié)構(gòu)相似性的層次聚類分析

表3 基于Bray-Curtis距離矩陣對(duì)各組樣本(除AR和EF)群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行置換多元方差分析(PERMANOVA) 檢驗(yàn)的結(jié)果

圖4 各樣本pH和Shannon指數(shù)的線性回歸分析及Pearson相關(guān)系數(shù)

圖5 綱水平微生物類群的冗余分析(RDA)

在屬水平 (圖6) 上，AR中的菌群與其他組具有明顯差異，特有的高豐度類群主要?dú)w為α變形菌綱、β變形菌目和擬桿菌綱，且明顯聚為一簇，其他低豐度的嗜酸性微生物極有可能遷移自酸性礦山排水。

整體來看，酸礦水坑中的菌群組成極為相似，亞鐵原體屬、酸硫桿菌屬、鉤端螺旋菌屬等豐度高且分布廣的類群明顯聚為一簇。亞鐵原體屬 (6.60%–86.34%) 的豐度與酸度呈顯著正相關(guān)，在條件極端的DS中達(dá)到最高，此時(shí)硫化芽胞桿菌屬的豐度也最高 (1.58%)。酸硫桿菌屬在酸礦水和沉積泥 (pH 2.0–2.5) 中的豐度達(dá)8.75%–38.29%。鉤端螺旋菌屬主要分布于BD和BS (11.82%和12.52%) 中。此外，BD中分布有最高豐度的酸桿菌屬(2.44%)、醋桿菌科 Acetobacteraceae未培養(yǎng)的類群 (5.90%)、嗜酸菌屬(11.12%)、鐵卵形菌屬(5.26%)和(2.16%) 等，而BS中主要為熱原體科 (Thermoplasmataceae) 的未培養(yǎng)類群 (15.81%)、(21.64%)、(0.63%)、A原體 (A-plasma) (3.17%) 和E原體 (E-plasma) (1.26%)[33]以及鐵線菌屬(1.04%) 等，這些微生物類群多與酸度呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。EF中主要為亞鐵原體屬和酸原體屬(79.26%和16.97%)，幾乎不存在 (平均相對(duì)豐度<0.01%) 或未測(cè)到酸硫桿菌屬和。

圖6 屬水平上微生物類群的相對(duì)豐度及與酸度的Pearson相關(guān)性組合熱圖

3 討論

3.1 酸性礦山排水環(huán)境菌群的分布及適應(yīng)性

結(jié)合群落結(jié)構(gòu)及菌群與環(huán)境因子相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，本研究蒙自酸礦水坑不同環(huán)境與周邊溪水群落組成差異較大，起主要作用的環(huán)境因子為pH。周邊溪水pH最高，群落豐富度也最高，主要有變形菌門β變形菌目和α變形菌綱以及擬桿菌門擬桿菌綱，其特有的高豐度類群在酸礦水坑中難以存活，只有少量存在于生物膜中 (圖6)，生物膜中可能形成了特殊的微環(huán)境。擬桿菌綱幾乎只分布于周邊溪水中，與pH呈明顯正相關(guān) (圖5)。通常擬桿菌門在酸性礦山排水中不常見，在環(huán)境酸度較低或測(cè)序深度足夠大的情況下偶有報(bào)道[22,34]，其僅有的耐酸類群最適pH大于5.0[35]?？烧J(rèn)為擬桿菌門不適應(yīng)酸性礦山排水環(huán)境，但與擬桿菌綱呈明顯正相關(guān)的β變形菌目和α變形菌綱中具有適應(yīng)性較好的鐵卵形菌屬和醋桿菌目，這些微生物主要分布于B區(qū)酸礦水中。

廣古菌門、變形菌門 (α、γ和δ變形菌綱)、硝化螺菌門、酸桿菌門、放線菌門和厚壁菌門等廣泛分布于蒙自酸礦水坑中，至少在一組中為豐富類群，這些微生物常見于酸性礦山排水環(huán)境且表現(xiàn)出很強(qiáng)的適應(yīng)性[22]，此外，Diapherotrites、浮霉?fàn)罹T、綠彎菌門、Dependentiae (TM6)[36]和藍(lán)細(xì)菌門也存在于酸礦水坑不同環(huán)境中，最近已有研究報(bào)道這些類群分布于不同的酸性礦山排水中[30,37]。本研究發(fā)現(xiàn)熱原體綱熱原體科未培養(yǎng)的類群 (ASV_8, 16, 19, 20) 與A、E原體和在沉積泥中豐度均較高，其分布特征與鉤端螺旋菌屬最為近似。酸桿菌門的主要存在于酸礦水中，而有研究發(fā)現(xiàn)該門的類群在沉積泥中豐度也較高[37]。值得關(guān)注的是，本研究酸礦水坑中具有高豐度的未分類的古菌 (ASV_7, 18, 25)，其與Rio Tinto河酸性礦山排水中未培養(yǎng)的古菌[38]聚為一個(gè)OTU，它們?cè)诃h(huán)境中的作用和適應(yīng)性有待進(jìn)一步研究。ARMAN-2是該環(huán)境中主要的Diapherotrites類群，在沉積泥和酸度更低的酸礦水中均有分布，而在生物膜中幾乎不存在；其他未培養(yǎng)的類群Sva0485和浮霉?fàn)罹T的CPla-3在酸礦水和沉積泥中均有分布，而綠彎菌門的AD3主要分布于沉積泥中，這些類群在酸性礦山排水中較少有報(bào)道[13,39]。

研究表明，pH對(duì)酸性礦山排水環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)具有重大影響。隨著硫化礦物的氧化性溶解，酸性礦山排水的pH不斷降低，進(jìn)而溶解更多的金屬和類金屬元素，離子濃度不斷升高，群落結(jié)構(gòu)及菌群分布可能也發(fā)生著適應(yīng)性的變化。本研究發(fā)現(xiàn)同區(qū)酸礦水和沉積泥的群落結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在群落組成豐度上，隨著pH的降低，酸礦水坑微生物群落多樣性明顯降低，表現(xiàn)為群落組成和結(jié)構(gòu)均趨于簡單，主要原因可能為熱原體綱對(duì)該環(huán)境的適應(yīng)性極強(qiáng)，其豐度與pH呈明顯負(fù)相關(guān)，在極端條件下對(duì)群落結(jié)構(gòu)起主導(dǎo)作用，在屬水平上表現(xiàn)為亞鐵原體屬在低pH采樣區(qū)中豐度明顯升高。

3.2 酸性礦山排水環(huán)境菌群的功能分析

鐵卵形菌屬主要分布于B區(qū)酸礦水 (pH 2.54±0.05) 中，在酸度和離子濃度更高的分組中均未測(cè)到。該屬成員以Fe2+和黃鐵礦自養(yǎng)生長，對(duì)有機(jī)物敏感[40]，廣泛分布于酸性礦山排水環(huán)境，中度嗜酸，在pH 2.0–4.0的條件下[22,41]和一些特殊生 境[42]中可占主要優(yōu)勢(shì)。推測(cè)鐵卵形菌屬主要在酸性礦山排水形成初期進(jìn)行鐵氧化，促進(jìn)礦石溶解，而隨著環(huán)境酸度和離子濃度的升高，其生態(tài)地位逐漸被其他鐵氧化菌取代。

酸硫桿菌屬在酸礦水和沉積泥中均有較高的豐度 (8.75%–38.29%)，可利用還原型無機(jī)硫化合物和S0作為能源自養(yǎng)生長，部分種 (.等) 還可利用Fe2+和黃鐵礦等硫化礦物，以及還原Fe3+[43]。該屬是酸性礦山排水中常見的嗜酸性鐵、硫氧化細(xì)菌，最適pH小于3。本研究從酸礦水樣本中分離得到了該屬多株菌，包含潛在新種，可應(yīng)用于生物浸礦中，促進(jìn)硫化礦物的氧化。鉤端螺旋菌屬 (0.09%–12.52%) 的豐度僅次于酸硫桿菌屬，spp.是嚴(yán)格好氧的嗜酸性鐵氧化細(xì)菌，以Fe2+作為唯一能源嚴(yán)格自養(yǎng)生長，對(duì)有機(jī)物極其敏感。相比于酸硫桿菌屬，該屬適應(yīng)更低的pH，在靠近礦石溶解的區(qū)域通過再生Fe3+對(duì)硫化礦物的氧化可能發(fā)揮著主要的促進(jìn)作用[44]。

亞鐵原體屬 (6.60%–86.34%) 在酸礦水坑中分布最廣，該屬在極端低pH和高濃度金屬離子的環(huán)境中廣泛分布且可占主要優(yōu)勢(shì)[12,45]，在生物浸礦體系和酸性礦山排水中相繼得到分離培養(yǎng)，極端嗜酸，好氧且兼性厭氧，能氧化Fe2+及還原Fe3+，同化CO2和有機(jī)碳源[46-47]。本課題組的一些研究表明，該屬鐵氧化能力極強(qiáng)。這類不具細(xì)胞壁的古菌在酸性礦山排水的形成和發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用[48]。

除鐵、硫氧化菌，酸礦水坑中還廣泛分布著酸桿菌屬、嗜酸菌屬、、鐵線菌屬、和硫化芽胞桿菌屬等嗜酸、中度嗜酸或耐酸的異養(yǎng)菌，通過利用環(huán)境中的有機(jī)物，驅(qū)動(dòng)C元素循環(huán)，促進(jìn)鐵、硫氧化菌的生長。此外，[49]、spp.和[50]可利用還原型無機(jī)硫化合物和S0以及Fe2+或硫化礦物兼性化能無機(jī)營養(yǎng)或混合營養(yǎng)生長，促進(jìn)礦石的氧化性溶解；spp.[51]、[52]、[53]、.、酸性礦山排水來源的spp.[54]和spp.中多個(gè)成員[55-56]均可在微好氧或厭氧的條件下還原Fe3+，直接參與Fe循環(huán)，產(chǎn)生Fe2+供鐵氧化菌利用及催化三價(jià)鐵礦的還原性溶解。結(jié)合成熟酸性礦山排水中的一些研究[57]及本研究微生物類群相關(guān)性分析的結(jié)果推測(cè)，spp.在極端條件下可能與亞鐵原體屬協(xié)同作用以溶解礦石。

4 結(jié)論

云南省蒙自某礦區(qū)酸性礦山排水環(huán)境酸礦水坑和周邊溪水的群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，pH是對(duì)其影響最大的環(huán)境因素。酸礦水坑群落多樣性較低，但具有豐富的嗜酸性鐵、硫氧化菌，以及代謝能力多樣的嗜酸性異養(yǎng)菌，是鐵、硫元素代謝和生物浸礦等研究和應(yīng)用的極端菌種資源庫。在嚴(yán)苛的環(huán)境條件下，酸礦水坑中還蘊(yùn)含著較多未分類和未培養(yǎng)的微生物類群，它們的生理代謝和環(huán)境功能可通過高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，但仍依賴于菌株分離培養(yǎng)來進(jìn)一步驗(yàn)證；環(huán)境中更為復(fù)雜的微生物之間的相互作用及其對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響也有待進(jìn)一步研究。另外，嗜酸菌的遷移及其對(duì)環(huán)境的影響也需引起足夠的關(guān)注。

[1] Johnson DB. Chemical and microbiological characteristics of mineral spoils and drainage waters at abandoned coal and metal mines. Water Air Soil Pollut, 2003, 3(1): 47–66.

[2] Akcil A, Koldas S. Acid mine drainage (AMD): causes, treatment and case studies. J Clean Prod, 2006, 14(12/13): 1139–1145.

[3] Kefeni KK, Msagati TAM, Mamba BB. Acid mine drainage: prevention, treatment options, and resource recovery: a review. J Clean Prod, 2017, 151: 475–493.

[4] Johnson DB, Hallberg KB. Acid mine drainage remediation options: a review. Sci Total Environ, 2005, 338(1/2): 3–14.

[5] Evangelou VP, Zhang YL. A review: pyrite oxidation mechanisms and acid mine drainage prevention. Crit Rev Environ Sci Technol, 1995, 25(2): 141–199.

[6] Singer PC, Stumm W. Acidic mine drainage: the rate-determining step. Science, 1970, 167(3921): 1121–1123.

[7] Schippers A, Sand W. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(1): 319–321.

[8] Baker BJ, Banfield JF. Microbial communities in acid mine drainage. FEMS Microbiol Ecol, 2003, 44(2): 139–152.

[9] Johnson DB, Hallberg KB. The microbiology of acidic mine waters. Res Microbiol, 2003, 154(7): 466–473.

[10] Bonnefoy V, Holmes DS. Genomic insights into microbial iron oxidation and iron uptake strategies in extremely acidic environments. Environ Microbiol, 2012, 14(7): 1597–1611.

[11] Dopson M, Johnson DB. Biodiversity, metabolism and applications of acidophilic sulfur-metabolizing microorganisms. Environ Microbiol, 2012, 14(10): 2620–2631.

[12] Bond PL, Druschel GK, Banfield JF. Comparison of acid mine drainage microbial communities in physically and geochemically distinct ecosystems. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(11): 4962–4971.

[13] Méndez-García C, Mesa V, Sprenger RR, et al. Microbial stratification in low pH oxic and suboxic macroscopic growths along an acid mine drainage. ISME J, 2014, 8(6): 1259–1274.

[14] Chen LX, Hu M, Huang LN, et al. Comparative metagenomic and metatranscriptomic analyses of microbial communities in acid mine drainage. ISME J, 2015, 9(7): 1579–1592.

[15] Méndez-García C, Peláez AI, Mesa V, et al. Microbial diversity and metabolic networks in acid mine drainage habitats. Front Microbiol, 2015, 6: 475.

[16] Kuang JL, Huang LN, He ZL, et al. Predicting taxonomic and functional structure of microbial communities in acid mine drainage. ISME J, 2016, 10(6): 1527–1539.

[17] Chen LX, Huang LN, Méndez-García C, et al. Microbial communities, processes and functions in acid mine drainage ecosystems. Curr Opin Biotechnol, 2016, 38: 150–158.

[18] Johnson DB, Hallberg KB. Carbon, iron and sulfur metabolism in acidophilic micro-organisms. Adv Microb Physiol, 2008, 54: 201–255.

[19] Rawlings DE, Johnson DB. The microbiology of biomining: development and optimization of mineral-oxidizing microbial consortia. Microbiology, 2007, 153(2): 315–324.

[20] Li KW, Zhang Q, Wang DP, et al. Isotope geochemistry of Bainiuchang silver polymetallic deposits in Mengzi, Yunnan. Mineral Deposits, 2010, 29(S1): 462–463 (in Chinese). 李開文, 張乾, 王大鵬, 等. 云南蒙自白牛廠銀多金屬礦床同位素地球化學(xué)研究. 礦床地質(zhì), 2010, 29(S1): 462–463.

[21] Chesnin L, Yien CH. Turbidimetric determination of available sulfates. Soil Sci Soc Am Proc, 1950, 15: 149–151.

[22] Kuang JL, Huang LN, Chen LX, et al. Contemporary environmental variation determines microbial diversity patterns in acid mine drainage. ISME J, 2013, 7(5): 1038–1050.

[23] Fuhrman JA, Comeau DE, Hagstr?m ?, et al. Extraction from natural planktonic microorganisms of DNA suitable for molecular biological studies. Appl Environ Microbiol, 1988, 54(6): 1426–1429.

[24] Edgar RC. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics, 2010, 26(19): 2460–2461.

[25] Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J, 2011, 17(1): 3.

[26] Edgar RC. UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads. Nat Methods, 2013, 10(10): 996–998.

[27] Edgar RC. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. BioRxiv, 2016: 081257.

[28] Bolyen E, Rideout JR, Dillon MR, et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nat Biotechnol, 2019, 37(8): 852–857.

[29] Wang Q, Garrity GM, Tiedje JM, et al. Naive Bayesian classifier for rapid assignment of rRNA sequences into the new bacterial taxonomy. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(16): 5261–5267.

[30] Korzhenkov AA, Toshchakov SV, Bargiela R, et al. Archaea dominate the microbial community in an ecosystem with low-to-moderate temperature and extreme acidity. Microbiome, 2019, 7: 11.

[31] Faith DP. Conservation evaluation and phylogenetic diversity. Biol Conservat, 1992, 61(1): 1–10.

[32] Tan S, Liu J, Fang Y, et al. Insights into ecological role of a new deltaproteobacterial orderAcidulodesulfobacterales by metagenomics and metatranscriptomics. ISME J, 2019, 13(8): 2044–2057.

[33] Yelton AP, Comolli LR, Justice NB, et al. Comparative genomics in acid mine drainage biofilm communities reveals metabolic and structural differentiation of co-occurring archaea. BMC Genomics, 2013, 14: 485.

[34] Cao ZM, Banda JF, Pei LX, et al. Microbial community structure characteristics in different mine drainage lakes of an iron mine in Anhui Province. Acta Microbiol Sin, 2019, 59(6): 1076–1088 (in Chinese). 曹子敏, Banda JF, 裴理鑫, 等. 安徽某鐵礦不同礦山廢水庫中微生物群落結(jié)構(gòu)特征. 微生物學(xué)報(bào), 2019, 59(6): 1076–1088.

[35] Sánchez-Andrea I, Sanz JL, Stams AJM.gen. nov., sp. nov., a propionigenic bacterium isolated from sediments of an acid rock drainage pond. Int J Syst Evol Microbiol, 2014, 64(12): 3936–3942.

[36] Yeoh YK, Sekiguchi Y, Parks DH, et al. Comparative genomics of candidate phylum TM6 suggests that parasitism is widespread and ancestral in this lineage. Mol Biol Evol, 2016, 33(4): 915–927.

[37] Mesa V, Gallego JLR, González-Gil R, et al. Bacterial, archaeal, and eukaryotic diversity across distinct microhabitats in an acid mine drainage. Front Microbiol, 2017, 8: 1756.

[38] Amaral-Zettler LA, Zettler ER, Theroux SM, et al. Microbial community structure across the tree of life in the extreme Río Tinto. ISME J, 2011, 5(1): 42–50.

[39] Gavrilov SN, Korzhenkov AA, Kublanov IV, et al. Microbial communities of polymetallic deposits' acidic ecosystems of continental climatic zone with high temperature contrasts. Front Microbiol, 2019, 10: 1573.

[40] Johnson DB, Hallberg KB, Hedrich S. Uncovering a microbial enigma: isolation and characterization of the streamer-generating, iron-oxidizing, acidophilic bacterium “”. Appl Environ Microbiol, 2014, 80(2): 672–680.

[41] Hua ZS, Han YJ, Chen LX, et al. Ecological roles of dominant and rare prokaryotes in acid mine drainage revealed by metagenomics and metatranscriptomics. ISME J, 2015, 9(6): 1280–1294.

[42] Hallberg KB, Coupland K, Kimura S, et al. Macroscopic streamer growths in acidic, metal-rich mine waters in north wales consist of novel and remarkably simple bacterial communities. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(3): 2022–2030.

[43] Falagán C, Moya-Beltrán A, Castro M, et al.sp. nov.: an extremely acidophilic sulfur-oxidizing chemolithotroph isolated from a neutral pH environment. Int J Syst Evol Microbiol, 2019, 69(9): 2907–2913.

[44] Schrenk MO, Edwards KJ, Goodman RM, et al. Distribution ofand: implications for generation of acid mine drainage. Science, 1998, 279(5356): 1519–1522.

[45] Golyshina OV, Timmis KN.and relatives, recently discovered cell wall-lacking archaea making a living in extremely acid, heavy metal-rich environments. Environ Microbiol, 2005, 7(9): 1277–1288.

[46] Golyshina OV, Pivovarova TA, Karavaiko GI, et al.gen. nov., sp. nov., an acidophilic, autotrophic, ferrous-iron-oxidizing, cell-wall-lacking, mesophilic member of the Ferroplasmaceae fam. nov., comprising a distinct lineage of the Archaea. Int J Syst Evol Microbiol, 2000, 50(3): 997–1006.

[47] Dopson M, Baker-Austin C, Hind A, et al. Characterization ofisolates andsp. nov., extreme acidophiles from acid mine drainage and industrial bioleaching environments. Appl Environ Microbiol, 2004, 70(4): 2079–2088.

[48] Edwards KJ, Bond PL, Gihring TM, et al. An archaeal iron-oxidizing extreme acidophile important in acid mine drainage. Science, 2000, 287(5459): 1796–1799.

[49] Hiraishi A, Nagashima KV, Matsuura K, et al. Phylogeny and photosynthetic features ofand related acidophilic bacteria: its transfer to the genusascomb. nov. Int J Syst Bacteriol, 1998, 48(4): 1389–1398.

[50] Johnson DB, Bacelar-Nicolau P, Okibe N, et al.gen. nov., sp. nov. andgen. nov., sp. nov.: heterotrophic, iron-oxidizing, extremely acidophilic actinobacteria. Int J Syst Evol Microbiol, 2009, 59(5): 1082–1089.

[51] Falagán C, Johnson DB.gen. nov., sp. nov.: an acidophilic ferric iron-reducing gammaproteobacterium. Extremophiles, 2014, 18(6): 1067–1073.

[52] Küsel K, Dorsch T, Acker G, et al. Microbial reduction of Fe(III) in acidic sediments: Isolation ofJF-5 capable of coupling the reduction of Fe(III) to the oxidation of glucose. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(8): 3633–3640.

[53] Ziegler S, Waidner B, Itoh T, et al.gen. nov., sp. nov., an alkalinizing gammaproteobacterium isolated from an acidic biofilm. Int J Syst Evol Microbiol, 2013, 63(4): 1499–1504.

[54] Falagan C, Foesel B, Johnson B.sp. nov.,sp. nov., andsp. nov.: novel acidobacteria isolated from metal-rich acidic waters. Extremophiles, 2017, 21(3): 459–469.

[55] Bridge TAM, Johnson DB. Reduction of soluble iron and reductive dissolution of ferric iron-containing minerals by moderately thermophilic iron-oxidizing bacteria. Appl Environ Microbiol, 1998, 64(6): 2181–2186.

[56] Johnson DB, Joulian C, d’Hugues P, et al.sp. nov., an acidophilic facultative anaerobic Firmicute isolated from mineral bioleaching operations. Extremophiles, 2008, 12(6): 789–798.

[57] Druschel GK, Baker BJ, Gihring TM, et al. Acid mine drainage biogeochemistry at Iron Mountain, California. Geochem Trans, 2004, 5: 13.

Microbial community structure and function in acid mine drainage from Mengzi, Yunnan Province

Zonglin Liang1,2, Yaling Qin1,2, Pei Wang1,2, Baojun Wang1,Zhenghua Liu4,5, Huaqun Yin4,5, Shuang-Jiang Liu1,2,3, and Cheng-Ying Jiang1,2,3

1 State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China 3 RCEES-IMCAS-UCAS Joint Laboratory for Environmental Microbial Technology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China 4 School of Minerals Processing and Bioengineering, Central South University, Changsha 410083, Hunan, China 5 Key Laboratory of Biometallurgy of Ministry of Education, Central South University, Changsha 410083, Hunan, China

In order to explore the microbial communities and functions in distinct environments of acid mine drainage (AMD) ecosystem and fully comprehend the patterns of AMD formation and development, high-throughput sequencing technology was used to study the prokaryotic community composition in AMD puddles and surrounding rills in a mining area in Mengzi, Yunnan Province, China. By combining with physicochemical properties of the samples, we distinguished the key factors affecting the community structure and analyzed the environmental functions of the microflora. We discovered that the main phyla in AMD puddles were Euryarchaeota, Proteobacteria (including the class α-, γ- and δ-Proteobacteria), Nitrospirae, Firmicutes, Actinobacteria, and Acidobacteria. Community structure of the AMD puddles apparently differed from that of the surrounding rills. Microbial diversity was significantly positively correlated with pH, whereas the relative abundance of Thermoplasmata was negatively correlated with pH and this class might play a predominant role in community structure. There was high relative abundance of the genus(6.60%–86.34%) in different samples of AMD puddles.spp. were the major iron- and/or sulfur-oxidizing bacteria in AMD solutions and sediments, whereas relative abundance of the obligate iron-oxidizerspp. was lower, andspp. were almost only present in the AMD solutions. In addition, acidophilic or acid-tolerant heterotrophic bacteria were widely distributed in the AMD solutions and sediments, which might promote the growth of iron- and/or sulfur-oxidizers and catalyze the oxidative/reductive dissolution of metal ores. Our results suggested that pH significantly impacted the microbial community structure of AMD environment by affecting the microbial diversity and microflora distribution.

acid mine drainage, high-throughput sequencing, microbial diversity, community structure, acidophile

November 12, 2019;

November 15, 2019

The Major Research Plan of National Natural Science Foundation of China (No. 91851206), National Natural Science Foundation of China (No. 31670124), National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2014CB846000), National Material Environmental Corrosion Platform of China.

Shuang-Jiang Liu. E-mail: liusj@im.ac.cn Cheng-Ying Jiang. Tel: +86-10-64807581; E-mail: jiangcy@im.ac.cn

梁宗林, 秦亞玲, 王沛, 等. 云南省蒙自酸性礦山排水微生物群落結(jié)構(gòu)和功能. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(11): 2035–2049.

Liang ZL, Qin YL, Wang P, et al. Microbial community structure and function in acid mine drainage from Mengzi, Yunnan Province. Chin J Biotech, 2019, 35(11): 2035–2049.

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (No. 91851206)，國家自然科學(xué)基金 (No. 31670124)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃) (No. 2014CB846000)，國家材料環(huán)境腐蝕平臺(tái)資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)