堿提杏鮑菇多糖PEAP-1的結(jié)構(gòu)初探及形貌觀察

梁 濤， 張 靜， 張力妮， 張化朋， 張 鵬， 劉阿娟

（1.陜西師范大學(xué) 食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安710062；2.陜西師范大學(xué) 物理學(xué)與信息技術(shù)學(xué)院，陜西西安 710062）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）俗稱刺芹側(cè)耳、雪茸、鮑魚菇、或干貝菇等[1]，為真菌界（Mycota）、真菌門（Eumycota）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、 同 擔(dān) 子 菌 亞 綱（Homobasidiomycetes）、傘菌目（Agaricales）、側(cè)耳科（Pleurotaceae）、側(cè)耳屬（Pleurotus）珍稀食用菌。主要分布于西歐國家以及南亞、中東一帶和我國的新疆、青海、四川地區(qū)，是高山、草原以及沙漠地帶的一種品質(zhì)優(yōu)良的大型肉質(zhì)傘菌，也是我國的珍稀名貴野生食用菌?，F(xiàn)代臨床研究表明，杏鮑菇具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗肝損傷和降血脂[4]、抗血管生成[5]等生物活性和藥理作用。

對杏鮑菇水提多糖的研究目前已有報道。楊立紅[6]等，從杏鮑菇子實體中分離純化出兩種杏鮑菇多糖，利用紫外光譜檢測，表明兩種多糖均不含核酸和蛋白質(zhì)；紅外光譜測定結(jié)果表明，兩種多糖均為含有葡萄糖醛酸的葡聚糖；小鼠實驗結(jié)果表明，杏鮑菇多糖對力竭小鼠具有明顯的抗氧化作用，對肝臟、骨骼肌有明顯抗損傷作用。Jung[3]等，對杏鮑菇多糖進(jìn)行硫酸化修飾，并研究硫酸化的程度對杏鮑菇多糖的結(jié)構(gòu)和生物活性的影響。結(jié)果表明，硫酸化修飾能夠加強杏鮑菇多糖的生物活性。然而對杏鮑菇堿提多糖的研究鮮見報道。利用稀堿溶液浸提，可以分離一些新穎的多糖組分，多糖的得率也大大提高[7]。由于稀堿液有助于解除植物細(xì)胞壁分子間的化學(xué)和物理作用，且堿提多糖具有一定的生物活性[8]。因此，筆者采用 DEAE-52纖維素和Sephadex G-150凝膠柱層析對堿提杏鮑菇粗多糖進(jìn)行分離純化，獲得均一多糖PEAP-1，并綜合采用高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、IR、剛果紅實驗、原子力顯微鏡（AFM）、環(huán)境電鏡掃描（SEM）等方法，分析其構(gòu)象和分子外貌，為今后堿提杏鮑菇多糖的研究及開發(fā)利用提供了結(jié)構(gòu)信息和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑 DEAE-52纖維素，Whatman公司提供；SphadexG-150，Pharmacia公司提供；標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖、標(biāo)準(zhǔn)單糖，Sigma提供；其它試劑均為AR級。

1.1.2 儀器 北京普析TU-1810型紫外可見分光光度計；Christ Alphal-4型真空冷凍干燥機(jī)；Waters1525型高效液相色譜儀 （Water2414型示差折光檢測器，色譜柱：Shodex Ohpak SB-804 HQ，流動相：超純水）；Agilent氣相色譜儀；FEI Quanta200型環(huán)境掃描電子顯微鏡；島津SPM-9500J3型原子力顯微鏡，Bruker Tensor27型紅外光譜儀。

1.1.3 杏鮑菇 陜西楊凌金麒麟生物科技有限公司提供。

1.2 杏鮑菇多糖的提取、分離及純化

1.2.1 提取及分離純化 杏鮑菇粗多糖參照文獻(xiàn)[9]的方法提取，提取率為8.6%。取粗多糖0.3 g溶于蒸餾水10 mL中，離心，上清液經(jīng)DEAE-52型纖維素柱層析分離，依次用蒸餾水，0.1、0.3及0.5 mol/L NaCl溶液洗脫，體積流量為0.6 mL/min，DBS-100型收集器進(jìn)行收集，每管8 mL，苯酚-硫酸法檢測，收集各組分洗脫液，減壓濃縮后冷凍干燥。主峰多糖組分為0.1 mol/L NaCl溶液洗脫所得組分，命名其為PEAP1，取PEAP1 30 mg溶于蒸餾水5 mL中，離心，上清液再經(jīng)Sephadex G-150型凝膠過濾柱層析純化，蒸餾水為洗脫液，體積流量為0.3 mL/min，每管收集3 mL，苯酚-硫酸法檢測，收集洗脫液，冷凍干燥得到多糖PEAP-1。

1.2.2 PEAP-1的純度和相對分子質(zhì)量測定 采用高效液相色譜法（HPLC）對PEAP-1多糖進(jìn)行純度鑒定。稱取PEAP-1適量，配制2 mg/mL質(zhì)量濃度多糖溶液，進(jìn)行HPLC分析。色譜條件：Waters1525型高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Shodex Ohpak SB-804 HQ，流動相為超純水，體積流量為0.8 mL/min，Waters2414型示差折光監(jiān)測器，柱溫30℃，進(jìn)樣量為20 μL，以洗脫峰的保留時間為橫坐標(biāo)，已知葡聚糖標(biāo)品相對分子質(zhì)量的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 PEAP-1的單糖組成分析 多糖的水解參照文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行，水解物制備多糖的糖睛乙酸酯衍生物[11]，衍生物進(jìn)行GC分析。色譜條件：Thermo TR-5石英毛細(xì)管柱 （30 m×0.32 mm ID×0.25 μm），F(xiàn)ID 檢測器，程序升溫：150 ℃（7 ℃/min）→190℃（15℃/min）→250℃；進(jìn)樣口溫度280℃，檢測器溫度260℃；載氣：N2體積流量30 mL/min，H2體積流量50 mL/min，空氣體積流量300 mL/min；進(jìn)樣量0.1 μL；內(nèi)標(biāo)：肌醇六乙酸酯。對照用標(biāo)準(zhǔn)單糖為：D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-甘露糖、L-鼠李糖。

1.2.4 PEAP-1的IR分析 稱取適量PEAP-1與適量干燥的KBr粉末混合研磨后壓片，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.2.5 PEAP-1的剛果紅實驗 2 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的PEAP-1溶液，與2 mL質(zhì)量濃度為50 μg/mL的剛果紅溶液，及1 mL不同濃度NaOH溶液（依次配成不同濃度0.05～0.5 mol/L）混合并搖勻，在25℃反應(yīng)10 min，用紫外分光光度儀進(jìn)行400～600 nm掃描，依次測定混合液在不同濃度NaOH溶液中最大吸收波長的變化。同時以2 mL剛果紅溶液和1 mL不同濃度NaOH溶液混合作為對照組。參見文獻(xiàn)[12]。

1.2.6 PEAP-1的原子力顯微鏡 將干燥的樣品1 mg溶于1 mL去離子蒸餾水中，封管在85℃水浴中加熱1 h，冷卻至室溫；再稀釋，直至樣品質(zhì)量濃度為10 μg/mL。置于磁力攪拌器持續(xù)攪拌24 h后，通過加熱使樣品溶解完全且減少聚集體的存在。取樣品溶液5 μL滴在新剝?nèi)〉脑颇副砻?，常溫常壓下空氣干燥，再滴加無水乙醇固定，防止多糖從云母片上脫落，樣片干燥后即可進(jìn)行AFM觀測。圖像在Contact模式下獲得，測試在室溫和大氣環(huán)境中進(jìn)行，濕度為 50%～60%，探針為 Si3N4，用 200 μm 長的微懸臂，力彈性常數(shù)為0.12 N/m。

1.2.7 PEAP-1的環(huán)境掃描電鏡 取多糖樣品粘著于樣品臺上，置真空噴鍍儀內(nèi)噴金鍍導(dǎo)電層，采用Quanta200型環(huán)境掃描電鏡進(jìn)行掃描；模式：高真空模式；電子槍加速電壓：20 kV[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEAP-1的理化性質(zhì)分析

杏鮑菇堿提多糖PEAP-1是一種淺黃色海綿狀固體，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。紫外全波長掃描顯示，在260、280 nm和可見區(qū)處均無吸收，說明PEAP-1不含核酸、蛋白質(zhì)和色素，在190 nm處有多糖的特征吸收峰。與碘-碘化鉀溶液反應(yīng)為陰性，說明其不含淀粉及纖維素；與菲林試劑反應(yīng)呈陰性，說明其不含還原糖。

2.2 PEAP-1純度和相對分子質(zhì)量測定

如圖1所示，PEAP-1在HPGPC中呈現(xiàn)單一對稱尖峰，表明其為均一多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖系列Dextran T-2000、T-500、T-70、T-40、T-10 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：lgMW=-0.665 0tR+9.995 8。式中，MW為標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的已知相對分子質(zhì)量，tR為其保留時間。根據(jù)HPLC的保留時間tR=6.524，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其相對分子質(zhì)量約為450 kDa。

圖1 PEAP-1高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of PEAP-1

2.3 PEAP-1的單糖組成分析

將PEAP-1完全水解物進(jìn)行糖腈乙酸酯衍生化，衍生物進(jìn)行GC分析。通過與標(biāo)準(zhǔn)品GC圖譜保留時間相比較，確定其單糖組成為葡萄糖和半乳糖，如圖2所示，并計算出單糖摩爾比為16.9∶0.37，說明PEAP-1是一種以葡萄糖為主的多聚糖。

圖2 PEAP-1氣相色譜圖Fig.2 GC of PEAP-1

2.4 IR分析

PEAP-1的紅外光譜從 400～4 000 cm-1，如圖3所示，3 365 cm-1為 （—OH官能團(tuán)）O—H的伸縮振動，2 932 cm-1為（-CH2-官能團(tuán)）C—H的伸縮振動，1 747 cm-1為（—COOH、—CHO或—COOR官能團(tuán)）C=O伸縮振動，1 629 cm-1為 （—C=O或—CHO官能團(tuán)）C=O的伸縮振動，1 442 cm-1為（—COOH官能團(tuán)）C—O的彎曲振動，1 382 cm-1為（—COOH官能團(tuán)）C=O的對稱伸縮振動，1 110 cm-1為（—C—O—C—官能團(tuán)）C—O的伸縮振動[14-15]。919 cm-1為（D-葡萄糖）的反對稱環(huán)振動[16]，832 cm-1為（D-半乳糖）C—H的彎曲振動[17]。600～950 cm-1為異頭區(qū)域，586 cm-1為吡喃糖環(huán)的骨骼模型[17-18]。

圖3 PEAP-1紅外光譜圖Fig.3 IR of PEAP-1

2.5 剛果紅

剛果紅（Congo red）是一種酸性染料，能溶于水和乙醇。有研究表明[19]，具有抗腫瘤活性的β-（1→3）葡聚糖，其構(gòu)象一般為三股螺旋構(gòu)象，而且有三股螺旋的β-（1→3）葡聚糖與剛果紅復(fù)合后，在0～0.2 mol/L NaOH溶液范圍內(nèi)，在可見光區(qū)的最大吸收波長（λmax）具有向波長（500 nm）方向移動的特點，因此在堿性介質(zhì)中，研究多糖剛果紅復(fù)合物的λmax可以得到多糖構(gòu)象的有關(guān)信息。

杏鮑菇堿提多糖PEAP-1的剛果紅實驗曲線如圖4所示，隨著NaOH濃度的增高，杏鮑菇堿提多糖與剛果紅的最大吸收波長相應(yīng)減小，但相對于剛果紅本身最大吸收波長減小明顯緩慢，雖然絡(luò)合物與剛果紅本身相比發(fā)生了紅移，但并未表現(xiàn)出具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖與剛果紅形成的絡(luò)合物在不同濃度的NaOH溶液中所表現(xiàn)出的亞穩(wěn)區(qū)，說明杏鮑菇堿提多糖不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。

2.6AFM表征

圖5（a）（b）分別為 10 μg/mL PEAP-1 不同放大倍數(shù)的原子力顯微鏡圖。從圖5（a）中可以看到，在云母表面，PEAP-1呈分子鏈形態(tài)并有少量的聚集體存在，這可能是由于多糖中含有糖醛酸而帶有負(fù)電荷，云母片本身也帶負(fù)電荷，所以云母片會和多糖樣品產(chǎn)生排斥，從而使多糖分子聚集成團(tuán)[20]。為了更清晰地觀察到多糖的真實形態(tài)，提高放大倍率，從圖5（b）中可以看見PEAP-1的無規(guī)則分子鏈形態(tài)，無三股螺旋結(jié)構(gòu)，這與剛果紅實驗結(jié)果相符。用AFM附帶軟件測得多糖單鏈的高度在0.13～1.2 nm之間，寬度在20～59 nm范圍內(nèi)。多糖分子單鏈直徑理論值在0.1～1 nm之間[21]，PEAP-1分子單鏈直徑與理論值相符，而寬度遠(yuǎn)大于單鏈分子的估算值，這是由于有限大小的針尖，在掃描時不同的部位與分子鏈作用，導(dǎo)致增寬效應(yīng)在DNA的AFM觀測中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象[22]。

圖4 PEAP-1剛果紅反應(yīng)Fig.4 Congo red reaction of PEAP-1

圖5 PEAP-1（10 μg/mL）原子力顯微鏡圖Fig.5 AFM of PEAP-1（10 μg/mL）

2.7 環(huán)境電鏡掃描

圖6（a）（b）分別是杏鮑菇堿提多糖試樣不同放大倍數(shù)的掃描電鏡圖像，掃描結(jié)果表明：在低倍率下（500×），樣品堆積 A、B、C 3 種形貌結(jié)構(gòu)，依次為光滑片狀、長桿狀和網(wǎng)狀，如圖6（a）所示，不能獲得多糖聚集體的微觀形貌信息。因此，提高放大倍率（5 000×），針對每一種類型多糖形貌進(jìn)行掃描，圖6（b）分別是高倍率下A、B和C的形貌。片狀結(jié)構(gòu)（A）表面緊密，較為平整，說明分子間相互作用較強，這與其較大相對分子質(zhì)量特性相吻合；長桿狀結(jié)構(gòu)（B）在空間上相互纏繞，相互支撐，排列松散，這很好地解釋了多糖在宏觀下“海綿”狀的形貌；網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（C）表面粗糙，網(wǎng)孔分布雜亂，大小不一，這可能是由于在冷凍干燥過程中冷肼制冷不足而使多糖表面未徹底凍結(jié)而引起的。這些形貌也可能與提取過程中堿液濃度過高或處理時間過長而引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞有關(guān)。

圖6 PEAP-1環(huán)境掃描電鏡Fig.6 SEM of PEAP-1

3 討論

長期以來，多糖界公認(rèn)多糖的活性在很大程度上取決于其相對分子質(zhì)量的大小，Lee等[23]從蛹蟲草培養(yǎng)菌絲中分離出一種相對分子質(zhì)量為210 kDa的高分子量多糖CPMN FrⅢ，其具有抗免疫特性。Gomaa等人[24]從炭疽菌的培養(yǎng)液中分離出相對分子質(zhì)量約為670 kDa的高分子葡聚糖，其具有抗腫瘤活性。同樣，杏鮑菇堿提多糖PEAP-1也是一種大分子量多糖，相對分子質(zhì)量達(dá)到450 kDa，其所具有的活性有待進(jìn)一步研究。

本課題中研究的多糖PEAP-1不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。雖有研究表明[19]，具有抗腫瘤活性的β-（1→3）葡聚糖，其構(gòu)象一般為三股螺旋構(gòu)象，但W Blaschek等人[25]從腐霉菌中提取出兩種大分子量的葡聚糖，都具有抗腫瘤活性但沒有螺旋結(jié)構(gòu)。Gomaa等人[24]從炭疽菌的培養(yǎng)液中分離出相對分子質(zhì)量約為 670 kDa 的高分子的 β-（1→3）-D-葡聚糖，其抗腫瘤活性與有序結(jié)構(gòu)無關(guān)。這說明不具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的多糖不一定沒活性。

多糖生物活性與化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系不僅建立在多糖分子的一級結(jié)構(gòu)上，而且還與多糖分子的高級結(jié)構(gòu)有關(guān)。AFM是一種新型的生物大分子高級結(jié)構(gòu)分析方法，由于其操作性好，靈敏度高，分析范圍可達(dá)到納米級等眾多優(yōu)勢，因而被廣泛應(yīng)用于分析生物大分子的高級結(jié)構(gòu)。蔡林濤等[23]在國內(nèi)首次采用AFM分析多糖結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明蟲草多糖分子鏈呈分枝結(jié)構(gòu)。孫潤廣等[26]用AFM觀察到甘草多糖的分子鏈呈多股緊密的螺旋結(jié)構(gòu)。本課題研究中AFM分析結(jié)果表明，PEAP-1多糖分子鏈呈無規(guī)則鏈狀且具有多分支結(jié)構(gòu)，多糖單鏈的高度在0.13～1.2 nm之間，寬度在20～59 nm范圍內(nèi)。

多糖的結(jié)構(gòu)分析較蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析復(fù)雜，這是因為組成多糖的單糖品種繁多，而且即使只有一種單糖，單糖殘基的組成、排列序列與連接方式等，因異頭物的構(gòu)型（α或β）、單糖基的構(gòu)型（L或D）、糖基環(huán)化方式（五元環(huán)或六元環(huán)）、有無側(cè)鏈、糖基上的羥基是否被取代（如硫酸基、磷酸基、?；桶被龋?、相鄰單糖基相連糖苷鍵的位置 （1→2，1→3，1→4，1→6 等）等的不同而不同，若多糖是由不同的單糖基所組成的雜多糖，其結(jié)構(gòu)還包括多糖基連接的順序[27]。本課題研究中IR分析結(jié)果表明，PEAP-1中存在D-葡萄糖和D-半乳糖吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)。單糖殘基異頭物的構(gòu)型（α或β），有條件將進(jìn)一步利用核磁表征多糖的結(jié)構(gòu)，這是今后需進(jìn)一步做的研究工作。

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