樺褐孔菌多糖IOP3a體內(nèi)抗腫瘤活性及其機(jī)制

陳義勇， 黃友如， 劉晶晶， 鄭麗雪， 徐 兵

（常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）是一種生長在寒帶的藥用真菌，寄生于白樺樹、銀樺等樹干或樹皮下，主要生長區(qū)域?yàn)楸泵?、波蘭、俄羅斯、中國的黑龍江和吉林、日本北海道等國家和地區(qū)[1]。國內(nèi)陳義勇等[2-3]研究表明，樺褐孔菌多糖對Jurkat荷瘤具有抗腫瘤活性；金光等[4]研究表明，樺褐孔菌多糖對小鼠S180肉瘤具有較強(qiáng)的抑制作用；張慧麗等[5]研究發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌多糖對肝癌SMMC7721細(xì)胞株增殖具有抑制作用，且表現(xiàn)出濃度相關(guān)性。國外Kim等[6-7]認(rèn)為，樺褐孔菌多糖對BDF1鼠黑色素瘤生長有明顯抑制作用，樺褐孔菌菌核多糖直接通過抑制腫瘤細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)合成而產(chǎn)生抗癌作用。通過查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，樺褐孔菌多糖的抗腫瘤活性主要停留在粗多糖研究層面，而樺褐孔菌多糖單一組分的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制還未見報(bào)道。

筆者前期分離得到一個(gè)樺褐孔菌多糖單一組分IOP3a，經(jīng)過活性篩選，發(fā)現(xiàn)IOP3a具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性，但是體內(nèi)抗腫瘤活性及其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。所以作者以IOP3a為研究對象，通過建立移植型裸鼠淋巴瘤細(xì)胞Jurkat模型，通過研究荷瘤裸鼠的指標(biāo)（如移植瘤體積變化、抑瘤率、脾指數(shù)、外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α和L-1β）以及裸鼠瘤塊組織病理學(xué)觀察，探討IOP3a的體內(nèi)抗腫瘤活性，通過蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測IOP3a處理后不同組荷瘤裸鼠的腫瘤組織中抑癌基因Bcl-2蛋白和促癌基因Bax蛋白的表達(dá)情況，分析樺褐孔菌多糖IOP3a可能的體內(nèi)抗腫瘤作用機(jī)制，旨在為其治療腫瘤及其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樺褐孔菌多糖IOP3a樣品 本實(shí)驗(yàn)室前期分離純化自制，經(jīng)HPLC測定IOP3a相對分子質(zhì)量為44265 Da，單糖由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為 2.5∶4.6∶1∶2.6。

1.1.2 Jurkat細(xì)胞 人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院。

1.1.3 Balb/c-nu/nu裸鼠 購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號：SCXK-（軍）2002-001。

1.2 主要試劑

5-氟尿嘧啶（5-Fu），上海利鉑化學(xué)技術(shù)有限公司提供；RPMI1640培養(yǎng)液，北京萬域美瀾科技有限公司提供；白細(xì)胞介素-1β（L-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供；鼠抗人Bcl-2，上海億欣生物科技有限公司提供；Bax單克隆免疫組化試劑盒，上海谷研科技有限公司提供；辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG，杰蘭爾試劑上海分公司提供；羊抗人β-肌動蛋白多克隆抗體，上海今邁生物科技有限公司提供；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒，天津百浩生物科技有限公司提供；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

RM2135石蠟切片機(jī)，德國Leica公司產(chǎn)品；DYCZ-25D型電泳儀，北京市六一儀器廠產(chǎn)品；36XB光學(xué)顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；LH750全自動血細(xì)胞分析儀，美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品；GelDoc-IT TS2凝膠成像系統(tǒng)，美國UVP公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Jurkat裸鼠荷瘤模型的建立 Balb/c-nu/nu裸鼠，雄性，3～5 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，放置在空氣凈化室飼養(yǎng)，室度（25±2）℃，實(shí)驗(yàn)過程達(dá)到無特定病原體（Specific Pathogen Free，SPF）條件，自由攝入無菌水和滅菌標(biāo)準(zhǔn)飼料一周后，裸鼠經(jīng)Co60照射（劑量250 Gcy）3 d后，在每只裸鼠背部皮下接種0.2 mL Jurkat細(xì)胞（1×107cells/mL），每只裸鼠兩個(gè)注射點(diǎn)，每天觀察裸鼠腫瘤形成情況，裸鼠皮下5 d后出現(xiàn)結(jié)節(jié)隆起約5 mm，成瘤率達(dá)到100%。成功建立的Jurkat裸鼠荷瘤模型見圖1。

圖1 Jurkat裸鼠荷瘤模型Fig.1 Cancer nude mice transplanted jurkat tumor

1.4.2 動物分組及給藥 造模后的Balb/c-nu/nu裸鼠隨機(jī)分為5組，包括空白對照組、5-Fu陽性對照

組（20 mg/（kg·d）、IOP3a 大劑量組（30 mg/（kg·d）、中劑量組（20 mg/（kg·d）和小劑量組（10 mg/（kg·d），每組5只。空白對照組每只裸鼠注射0.2 mL生理鹽水，5-Fu陽性對照組每只裸鼠注射0.2 mL 5-Fu，調(diào)節(jié)藥物濃度使藥量達(dá)到20 mg/kg，采用灌胃法給藥，每天一次，連續(xù)28 d。

1.4.3 荷瘤裸鼠移植瘤體積變化 每組裸鼠從給樣品后開始，用游標(biāo)卡尺分別在第7、14、28天作一次活體腫瘤大?。òㄗ畲箝L徑a和橫徑b）測量，根據(jù)公式

計(jì)算腫瘤體積（V），以每組裸鼠瘤體積平均值為縱坐標(biāo)，處理時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制移植瘤生長曲線。參見文獻(xiàn)[8]。

1.4.4 IOP3a對荷瘤裸鼠的抑瘤作用 實(shí)驗(yàn)第29天后處死裸鼠后稱重，摘取瘤塊，用生理鹽水洗滌，然后用濾紙吸干稱重，根據(jù)公式

1.4.5 IOP3a對荷瘤裸鼠脾臟的影響 實(shí)驗(yàn)第29天后處死裸鼠，摘取脾臟，用生理鹽水洗滌，然后用濾紙吸干稱重，根據(jù)公式

計(jì)算脾臟指數(shù)。

1.4.6 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響 實(shí)驗(yàn)第29天后通過裸鼠眼眶取血，經(jīng)全自動血細(xì)胞分析儀計(jì)算白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)。

1.4.7 IOP3a對裸鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響詳見文獻(xiàn)[9]。

1）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的制備：裸鼠頸椎脫臼處死，酒精消毒，腹腔注射5 mL RPMI1640培養(yǎng)液，輕揉腹腔3 min，收集腹腔液，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×109/L。將巨噬細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，37℃條件下在5%CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，吸棄培養(yǎng)液，用RPMI1640培養(yǎng)液洗去未貼壁的細(xì)胞，即得純化的裸鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

2）L-1β和TNF-α含量的測定：將96孔培養(yǎng)板中的裸鼠腹腔巨噬細(xì)胞分為陰性對照組、陽性對照組和不同劑量的IOP3a多糖給藥組，吸棄上清液，陰性對照組加入150 μL的RPMI1640培養(yǎng)液，陽性對照組加入150 μL含5-Fu的 RPMI1640培養(yǎng)液（質(zhì)量濃度10 mg/L），給藥組每孔分別加入150 μL含IOP3a多糖的RPMI1640培養(yǎng)液 （質(zhì)量濃度分別為 50、100、200 mg/L）， 每組設(shè) 6個(gè)復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)48 h后，吸取上清液，用雙抗夾心ELISA法測定培養(yǎng)上清液中L-1β和TNF-α的水平，操作步驟按檢測試劑盒中的說明書進(jìn)行。

1.4.8 瘤塊組織切片病理學(xué)觀察 取裸鼠Jurkat瘤塊組織，用體積分?jǐn)?shù)10%甲醛固定24 h，通過常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片（厚度4 μm）、蘇木精-伊紅染色，對裸鼠Jurkat瘤塊組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。

1.4.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測Jurkat腫瘤組織中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá) 稱取腫瘤組織0.3 g，4℃條件下用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌4次，將組織剪碎后加入5 mL預(yù)冷組織裂解液，冰上裂解60 min，裂解產(chǎn)物在4℃條件下5 000 r/min離心20 min）后得到細(xì)胞蛋白上清液，采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，根據(jù)蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果每孔加入20 μg蛋白質(zhì)，在待測細(xì)胞蛋白上清液中加入等體積的加樣緩沖液，然后混合，在沸水浴中加熱5 min，進(jìn)行SDSPAGE凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后用去離子水漂洗凝膠，冰浴條件下將蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用PBST（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%Tween-PBS）配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉溶液在37℃條件下膜封閉2 h，然后分別加入一抗（1∶200稀釋）鼠抗人 Bax、Bcl-2和β-Actin（β-肌動蛋白），確定上樣量的一致性，室溫下反應(yīng)2 h后用PBST清洗3次，每次15 min，再與辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1∶800稀釋）室溫下反應(yīng)1 h，用PBST充分洗滌后，DAB室溫下顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)分析免疫組化圖片。

1.4.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SAS軟件AVOVA程序進(jìn)行顯著性分析，Duncan程序進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線

荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線如圖2所示。可知，與對照組比較，IOP3a大劑量組瘤體積增長最慢，而對照組裸鼠移植瘤體積持續(xù)增長，說明IOP3a具有較好的抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長的作用。

2.2 IOP3a對裸鼠Jurkat肉瘤的抑制作用

裸鼠連續(xù)給藥28 d后，各組荷瘤裸鼠的瘤質(zhì)量、抑瘤率等見表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明：與陰性對照組的瘤質(zhì)量相比，IOP3a高、中劑量組瘤質(zhì)量均有顯著性差異 （p＜0.05）， 抑瘤率分別為 69.28%和57.62%，隨著多糖劑量的增加，裸鼠移植性腫瘤質(zhì)量下降顯著，并存在明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，5-Fu陽性對照組瘤質(zhì)量與陰性對照組的瘤質(zhì)量相比差異顯著（p＜0.05），發(fā)現(xiàn)裸鼠的進(jìn)食量、行為狀態(tài)等狀況明顯差于IOP3a組，這主要是因?yàn)?-Fu會對裸鼠的免疫器官造成一定的損害，而樺褐孔菌多糖IOP3a對裸鼠的免疫沒有損害。

圖2 荷瘤裸鼠移植瘤生長曲線Fig.2 Growth curve of nude mice transplanted jurkat tumor

表1 IOP3a對裸鼠Jurkat肉瘤的抑制作用（，n=5）Table 1 Anti-tumor activities of IOP3a against tumorbearing nude mice（，n=5）

表1 IOP3a對裸鼠Jurkat肉瘤的抑制作用（，n=5）Table 1 Anti-tumor activities of IOP3a against tumorbearing nude mice（，n=5）

注：與陰性對照組比較，a： p＜0.05。

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2.3 IOP3a對荷瘤裸鼠免疫器官的影響

樺褐孔菌多糖IOP3a對荷瘤裸鼠免疫器官脾臟的影響見表2，可知：與陰性對照組相比，5-Fu陽性組脾臟指數(shù)明顯降低（p＜0.05），表現(xiàn)出一定的毒副作用，IOP3a治療組的脾臟指數(shù)與陰性對照組均無顯著性差異，無明顯毒副作用，并且明顯高于5-Fu組（p＜0.01），隨著劑量的增加，脾臟指數(shù)有逐步增加的趨勢。

表2 IOP3a對荷瘤裸鼠脾臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of IOP3a on spleen index of tumorbearing nude mice（，n=5）

表2 IOP3a對荷瘤裸鼠脾臟指數(shù)的影響Table 2 Effect of IOP3a on spleen index of tumorbearing nude mice（，n=5）

注：與陰性對照組比較，a：p＜0.05；與陽性對照組比較b： p＜0.01。

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2.4 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響

樺褐孔菌多糖IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響見表3，可知：與陰性對照組相比，5-Fu組白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)均明顯降低 （p＜0.05）；與5-Fu陽性對照組相比，IOP3a作用的荷瘤裸鼠的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)高于陽性對照組 （p＜0.01），說明IOP3a具有一定的升高裸鼠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能。

表3 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響（，n=5）Table3 EffectofIOP3a on whiteblood celland Lymphocyte of nude mice（，n=5）

表3 IOP3a對荷瘤裸鼠外周血白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的影響（，n=5）Table3 EffectofIOP3a on whiteblood celland Lymphocyte of nude mice（，n=5）

注：與陰性對照組比較，a：p＜0.05；與陽性對照組比較b： p＜0.01。

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2.5 IOP3a對裸鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響

IOP3a對裸鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子L-1β和TNF-α的影響見表4?？梢钥闯?，與陰性對照組相比，IOP3a多糖對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNF-α和 L-1β 均有明顯的促進(jìn)作用 （P＜0.01，P＜0.05），且IOP3a多糖對TNF-α的促進(jìn)作用具有劑量依賴關(guān)系，在IOP3a多糖質(zhì)量濃度為200 mg/L時(shí)最為顯著，培養(yǎng)上清液中TNF-α的質(zhì)量濃度達(dá) （279.35±36.24）ng/L，而IOP3a多糖對L-1β的促進(jìn)作用無劑量依賴關(guān)系，在IOP3a多糖質(zhì)量濃度為100 mg/L時(shí)最為顯著，培養(yǎng)上清液中L-1β的質(zhì)量濃度達(dá)（49.32±12.09）ng/L，與陽性對照5-Fu相比無明顯差異。

表4 IOP3a對裸鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響Table 4 Effect of IOP3a on generation of cytokines from macrophage of nude mouse

2.6 組織病理學(xué)觀察

裸鼠連續(xù)給藥28 d后，裸鼠Jurkat肉瘤病理組織學(xué)觀察見圖3。可以看出：陰性對照組腫瘤結(jié)構(gòu)無明顯改變，生長旺盛，IOP3a組、5-Fu組腫瘤體積明顯小于陰性對照組，瘤塊組織松脆，IOP3a組瘤組織出現(xiàn)壞死，有明顯的腫瘤壞死灶，5-Fu陽性組瘤組織大面積壞死，結(jié)構(gòu)不清。

圖3 裸鼠Jurkat肉瘤病理組織學(xué)（400×）Fig.3 Histopathology of tumors from transplanted tumor nude mice（400×）

2.7 IOP3a對裸鼠Jurkat腫瘤組織中Bax和Bcl-2基因蛋白表達(dá)的影響

Bcl-2家族蛋白根據(jù)其功能分為兩類：一類以Bax、Bad、Bak、Bid 為代表，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；另一類以Bcl-2、Bcl-xl為代表，抑制細(xì)胞凋亡，Bcl-2家族蛋白通過二聚體網(wǎng)絡(luò)形式相互作用，調(diào)控細(xì)胞的凋亡[10-11]。IOP3a對裸鼠 Jurkat腫瘤組織中 Bax和Bcl-2基因蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖4和表5。

由圖4可知：β-Actin（β-肌動蛋白）基因表達(dá)量不隨藥物處理變化，呈現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)，隨著IOP3a處理濃度的增大，Jurkat腫瘤組織細(xì)胞中Bax基因表達(dá)條帶變寬、變深，光密度值與陰性對照組相比不斷增大，差異顯著（p＜0.05），見表 5，明顯抑制Bcl-2基因的表達(dá)（p＜0.05）。5-FU組顯著地促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞中Bax基因蛋白的表達(dá)，同樣明顯抑制Bcl-2基因的表達(dá)（p＜0.05）。表明 IOP3a通過促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)、抑制Bcl-2表達(dá)起到抗腫瘤作用。

圖4 IOP3a對裸鼠Jurkat腫瘤組織中Bax和Bcl-2基因蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of IOP3a on expression of Bax and Bcl-2 in Jurkat tumors from the transplanted tumor nude mice through immunohistochemical analysis

表5 不同組Bax、Bcl-2基因蛋白表達(dá)定性分析Table 5 Quantitative analysis of the expression of Bax and Bcl-2 proteins

3 結(jié)語

通過對IOP3a體內(nèi)抗腫瘤作用及其機(jī)制進(jìn)行研究，得出如下結(jié)論：

1）通過建立裸鼠Jurkat模型評價(jià)IOP3a的體內(nèi)抗腫瘤效果，IOP3a可以明顯地抑制荷瘤裸鼠腫瘤體積，具有很好的抑制腫瘤生長的作用。IOP3a高、中劑量組瘤質(zhì)量與陰性對照組的瘤質(zhì)量相比均有顯著性差異（p＜0.05），腫瘤抑制率分別為69.28%和57.62%，有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，隨著劑量的增加，脾臟指數(shù)有逐步增加的趨勢，具有升高裸鼠白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的功能，IOP3a多糖對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子TNF-α和L-1β均有明顯的促進(jìn)作用，組織病理學(xué)觀察表明，IOP3a可使腫瘤組織中呈現(xiàn)明顯腫瘤壞死灶、瘤組織出現(xiàn)壞死的現(xiàn)象。

2）免疫組化表明，IOP3a通過促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)、抑制Bcl-2表達(dá)起到抗腫瘤的作用。

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