桔皮中橙皮苷的新型雙水相萃取

朱紅菊 ， 丁 玉 ， 賈亞偉

（1.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 國(guó)家煤加工與潔凈化工程技術(shù)研究中心，江蘇 徐州221116；2.中國(guó)礦業(yè)大學(xué) 化工學(xué)院，江蘇 徐州 221116；3.江蘇洋河酒廠股份有限公司技術(shù)中心，江蘇 宿遷 223800）

橙皮苷具有抗氧化、降血脂、消炎、維持滲透壓、增強(qiáng)毛細(xì)血管韌性及降低膽固醇等作用[1-3]，被廣泛用于醫(yī)藥及日用化工等領(lǐng)域[4-6]。同時(shí)，作為天然抗氧化劑、食品添加劑、果蔬保鮮劑及保健品等，也被食品行業(yè)廣泛應(yīng)用。

傳統(tǒng)的雙水相體系是由兩種水溶性高分子或一種水溶性高分子與無機(jī)鹽組成的混合體系。與其他常規(guī)分離方法相比，其顯著特點(diǎn)及獨(dú)有的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于：由于兩相均為水相，故兩相界面張力極低，大大低于有機(jī)溶劑與水相之間的相間張力，故相分離條件溫和，相間傳質(zhì)和平衡過程迅速，產(chǎn)物回收率高。另外，低的界面張力有助于保持被分離物質(zhì)的生物活性，特別適合于分離有生物活性的物質(zhì)，在生物大分子等生物類產(chǎn)品的分離過程中得到廣泛應(yīng)用[7]?；诖?，為了增加雙水相體系的選擇性，近年來有諸如雙水相與其它分離技術(shù)的集成化、親和雙水相等萃取技術(shù)的不斷發(fā)展[8-10]。但這類雙水相體系的主要不足是用于分離的高分子聚合物價(jià)格昂貴、難以回收、黏度大、聚合物難處理及環(huán)境污染等[11]，限制了它們的工業(yè)化應(yīng)用。

近年來，先后出現(xiàn)了無機(jī)鹽-低分子有機(jī)溶劑雙水相體系[12]、離子液體雙水相體系[13-15]，以及表面活性劑的雙水相體系[16]等。這類雙水相體系具有傳統(tǒng)體系所沒有的一些特點(diǎn)，如分相快、成本低、易于處理等。其中以無機(jī)鹽/低分子有機(jī)溶劑形成的雙水相體系最為價(jià)廉、易得，近年來得到廣泛應(yīng)用[17-20]，且多以微波、超聲等手段輔助，以增強(qiáng)萃取效果。用于黃酮類化合物提取的這類雙水相體系主要是由一些低分子醇類與硫酸銨構(gòu)成[17-18，20]，多用于不同天然產(chǎn)物中黃酮類物質(zhì)的分離。但這類體系對(duì)橙皮苷的選擇性如何，則研究較少，而對(duì)于除低分子醇類之外的有機(jī)溶劑更少有人涉及。由于分離是利用目的產(chǎn)物與雜質(zhì)的性質(zhì)不同而進(jìn)行，故萃取介質(zhì)的不同必然會(huì)影響目的產(chǎn)物的分離程度。因此，有必要對(duì)低分子醇類以外的有機(jī)溶劑及硫酸銨以外的鹽類的雙水相構(gòu)成及性質(zhì)進(jìn)行研究，以尋求最佳的雙水相萃取體系，豐富雙水相的構(gòu)成。

作者采用新型親水性低分子有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽雙水相體系純化橙皮苷，輔以纖維素酶助提取，考察不同的低分子有機(jī)物質(zhì)及無機(jī)鹽類對(duì)橙皮苷純化的影響。采用制備型高效液相色譜（HPLC）對(duì)其進(jìn)一步純化。用HPLC檢測(cè)所得橙皮苷的純度及橙皮苷回收率，以考察新型雙水相體系對(duì)橙皮苷的分離特異性及其純化效率。

1 材料與方法

1.1 粗提物制備

市購蜜桔取皮、清洗、冷凍干燥至恒重。粉碎、過40目篩，所得桔皮粉冷藏備用。

取適量桔皮粉于錐形瓶中，加入乙醇并輔以纖維素酶，水浴振蕩浸提30 min后滅酶、冷卻，抽濾得粗提液待用。

1.2 雙水相成相

關(guān)于乙醇、丙醇等低分子醇類與硫酸銨形成的雙水相體系研究者眾多，故本研究取異丙醇、丙酮及3種無機(jī)鹽類構(gòu)建雙水相體系，進(jìn)一步考察這類物質(zhì)的成相性質(zhì)及對(duì)目的產(chǎn)物的選擇性。

分別取異丙醇/（NH4）2SO4、異丙醇/Na2CO3、異丙醇/K2HPO4、丙 酮/（NH4）2SO4、 丙酮/Na2CO3、丙 酮/K2HPO46對(duì)物質(zhì)進(jìn)行研究，用濁點(diǎn)法繪制各自雙節(jié)線圖（相圖），考察最優(yōu)成相、萃取體系。

1.3 雙水相體系萃取

將一定量構(gòu)成雙水相體系的有機(jī)溶劑、無機(jī)鹽置于離心管中，取橙皮苷粗提液與之混合，調(diào)節(jié)pH，旋渦混合，一定溫度下恒溫萃取一定時(shí)間后，記錄兩相體積，用紫外分光光度法測(cè)定橙皮苷濃度。計(jì)算相比R，分配系數(shù)K和回收率Y。

1.4 橙皮苷粗品制備

將雙水相上相溶液加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鹽酸溶液調(diào)pH為4.0，加熱至65℃，冷卻過夜結(jié)晶，過濾洗滌數(shù)次，真空冷凍干燥得橙皮苷粗品。

1.5 制備型HPLC精制

將所得粗品用流動(dòng)相稀釋至相應(yīng)濃度，與標(biāo)準(zhǔn)品溶液及流動(dòng)相進(jìn)行超聲處理，過0.45 μm的濾膜后上樣。梯度洗脫，收集主要峰值流出液。

制備條件：色譜柱DAC-HB50-C18（Φ50 mm×250 mm，10 μm）；紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng) 286 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量15 mL；流動(dòng)相體積流量55 mL/min。

1.6 相關(guān)計(jì)算

1.6.1 雙水相萃取收率

式（1）中：R為雙水相體系上下相體積之比；K為雙水相體系分配系數(shù)。

1.6.2 相比

式（2）中：Vt，Vb為雙水相體系上、下相體積，mL。

1.6.3 分配系數(shù)

式（3）中：Ct，Cb為上、下相中橙皮苷的質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.6.5 總回收率Y計(jì)算

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系萃取橙皮苷

2.1.1 雙水相體系成相研究 一般認(rèn)為，普通有機(jī)物形成雙水相是鹽溶液與有機(jī)溶劑爭(zhēng)奪水分子形成締合水合物的結(jié)果。通過繪制雙水相雙節(jié)線圖，選擇合適的雙水相體系。3種鹽分別與丙酮、異丙醇構(gòu)成雙水相體系，見圖1。

圖1 不同雙水相體系的成相相圖Fig.1 Phase diagram for different aqueous two-phase Systems

由圖1可以看出，碳酸鈉形成穩(wěn)定的雙水相體系所需鹽及醇量均較少，意即其分相能力最強(qiáng)。磷酸氫二鉀具有較寬的分相范圍。

2.1.2 雙水相體系構(gòu)成對(duì)橙皮苷選擇性的影響取碳酸鈉與磷酸氫二鉀進(jìn)一步研究，分別與異丙醇、丙酮構(gòu)成4組雙水相體系，即異丙醇/Na2CO3、異丙醇/K2HPO4、丙酮/Na2CO3、丙酮/K2HPO4體系，探討橙皮苷粗品在兩相間的分配情況，考察體系對(duì)橙皮苷的選擇性。各體系的成相相比、分配系數(shù)及橙皮苷收率見表1。

表1 橙皮苷在不同雙水相體系中分配效果比較Table 1 Comparison ofhesperidin partitioning in different aqueous two-phase systems

由表1可知，橙皮苷在丙酮/K2HPO4體系中雖然相比不太理想，但分配系數(shù)較大，表明該體系的選擇性較高，其回收率Y1可達(dá)到93.77%。因而確定丙酮/K2HPO4體系作為萃取橙皮苷的適宜雙水相體系。

2.1.3 丙酮和K2HPO4質(zhì)量濃度對(duì)橙皮苷選擇性的影響 取系統(tǒng)總質(zhì)量20 g，加入相當(dāng)0.20 g橙皮苷的粗提液，在pH 9.0、室溫情況下，考察K2HPO4、丙酮質(zhì)量濃度對(duì)橙皮苷粗品在兩相間的選擇性及回收率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，K2HPO4、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)橙皮苷粗品的萃取效果影響較為顯著；當(dāng)K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時(shí)，隨著丙酮量的增加，分配系數(shù)K和萃取率Y1總是先明顯上升，而后趨于平穩(wěn)或略有下降。這是由于體系分相能力隨丙酮量增加而增大，更有利于橙皮苷分配于上相，提高萃取率；但丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高，就會(huì)有更多的水進(jìn)入上相，而使分配系數(shù)降低，同時(shí)K2HPO4的水化作用不足以奪取這些水分子而出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象。而K2HPO4的量也不宜太高，否則導(dǎo)致相比進(jìn)一步降低，加之鹽析的同時(shí)作用，會(huì)造成橙皮苷萃取率下降，導(dǎo)致原料浪費(fèi)。欲提高萃取收率Y1，必須同時(shí)考慮分配系數(shù)K和相比R兩個(gè)參數(shù)的作用。因此，取質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%丙酮-質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%K2HPO4構(gòu)成的雙水相體系作為后續(xù)萃取體系。

圖2 K2HPO4、丙酮質(zhì)量濃度對(duì)橙皮苷粗品選擇性影響Fig.2 Effect of dipotassium hydrogen phosphate and acetone concentration on the selectivety of crude hesperidin

2.1.4 粗提物用量對(duì)橙皮苷選擇性的影響 仍取系統(tǒng)總質(zhì)量為20 g、pH 9.0，室溫操作，固定K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%，考察粗提物加入量對(duì)橙皮苷萃取過程的影響，結(jié)果示于表2。

繼續(xù)加大人才培養(yǎng)與引進(jìn)力度，一方面支持在崗職工通過外出進(jìn)修學(xué)習(xí)、出國(guó)深造、提升學(xué)歷等途徑，不斷提升現(xiàn)有醫(yī)務(wù)人員的工作能力和學(xué)歷層次。另一方面，則通過廣納各方賢才，吸引更多優(yōu)秀的高層次人才來院工作，進(jìn)一步優(yōu)化學(xué)科結(jié)構(gòu)，形成合理的內(nèi)部競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)醫(yī)院的可持續(xù)發(fā)展。

由表2可以看出，分配系數(shù)K、萃取率Y1隨著粗提物量的加大而不斷波動(dòng)，但在用量達(dá)到0.4 g后，相比下降，Y呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜合考慮，取粗提物用量為0.4 g。

2.1.5 溫度對(duì)橙皮苷分配系數(shù)的影響 固定上述條件，即系統(tǒng)總質(zhì)量20 g，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%，pH 9.0，粗提物加入量0.4 g。不同溫度下橙皮苷粗品的萃取收率與分配系數(shù)等參數(shù)變化如表3所示。

表2 粗提物用量對(duì)橙皮苷分配的影響Table 2 Effect of the amount of crude hesperidin on its partitioning

表3 溫度對(duì)橙皮苷分配系數(shù)的影響Table 3 Effect of temperature on the partition coefficient of crude hesperidin

由表3可知，隨著溫度上升，分配系數(shù)略有增加，相比未見變化，橙皮苷的萃取收率幾乎無變化。出于操作方便和節(jié)能降耗的考慮，萃取溫度取為室溫。

2.1.6 pH值的影響 萃取條件固定為：系統(tǒng)總質(zhì)量為20 g，K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%，室溫，粗提物加入量0.4 g。一般而言，丙酮/K2HPO4雙水相體系成相時(shí)，溶液pH范圍在7～12之間。因此，考察此區(qū)間內(nèi)pH值對(duì)橙皮苷粗品萃取過程的影響，結(jié)果見表4。

表4 pH值對(duì)橙皮苷分配系數(shù)的影響Table 4 Effect of pH value on the partition coefficient of crude hesperidin

由表4可知，pH值在7～10之間時(shí)，隨著pH值的增加，相比R與分配系數(shù)K不斷增大，橙皮苷萃取收率上升趨勢(shì)顯著，pH=10時(shí)萃取收率達(dá)到最大值。pH大于10后，相比與選擇性均降低，萃取收率亦緩慢下降。這可能是因?yàn)樵趐H＜10時(shí)，隨著pH的增加，溶液中水解產(chǎn)生的H2PO4-減少而HPO42-相應(yīng)有所增加。負(fù)電荷的增多致使其對(duì)橙皮苷酚羥基氧負(fù)離子的排斥作用增強(qiáng)，從而促使更多的橙皮苷分配于上相，提高了橙皮苷的分配系數(shù)。pH＞10后，K2HPO4會(huì)進(jìn)一步電離，上、下相的差別縮小，從而使得橙皮苷的選擇性減少。最后導(dǎo)致其萃取收率下降。

2.2 HPLC制備橙皮苷

2.2.1 流動(dòng)相及洗脫方式對(duì)橙皮苷分離的影響以甲醇溶劑為對(duì)照液，用紫外可見分光光度計(jì)對(duì)質(zhì)量濃度1.5 mg/mL的橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品于波長(zhǎng)200～600 nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)連續(xù)掃描，發(fā)現(xiàn)在286 nm處有特征吸收峰。因此，以286 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，對(duì)雙水相純化后的橙皮苷樣品進(jìn)行HPLC精制純化。

配制質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的樣品溶液，按一定的色譜條件進(jìn)行HPLC實(shí)驗(yàn)。考察不同流動(dòng)相及洗脫方式對(duì)樣品分離效果的影響。按以下3種洗脫方式進(jìn)行考察：

1）純甲醇洗脫方式。

2）固定 v（甲醇）∶v（水）=45∶55 的洗脫方式。

3）梯度洗脫方式。以甲醇與水的初始體積比例為40∶60開始，不斷增加甲醇比例至二者體積比例達(dá)到1∶1。而后，逐漸恢復(fù)初始比例，直至洗脫結(jié)束。所得結(jié)果分別示于圖3—5。

圖3 純甲醇洗脫時(shí)樣品的流出情況Fig.3 Elution profile while methanol as the elution solvent

圖4 v（甲醇）∶v（水）=45∶55 比例洗脫時(shí)樣品流出情況Fig.4 Elution profile of sample when the ratio of methanol to water is 45∶55

圖5 梯度洗脫時(shí)樣品流出情況Fig.5 Elution profile of sample as gradient elution strategy

由圖3—5可見，流動(dòng)相為純甲醇時(shí)，出峰時(shí)間較早，但是分離效果較差，并且有拖尾現(xiàn)象和溶劑峰干擾；流動(dòng)相為甲醇-水（體積比 45∶55）時(shí)，出峰時(shí)間較適宜，峰形較佳，但部分組分不能完全分開；流動(dòng)相為梯度洗脫時(shí)，出峰時(shí)間適中，每個(gè)組分基本可逐一分離，但個(gè)別峰有前滯現(xiàn)象。綜合考慮，采取梯度洗脫法精制橙皮苷。

2.2.2 HPLC精制橙皮苷 按以上色譜條件對(duì)樣品進(jìn)行精制。以質(zhì)量濃度1.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品作為基準(zhǔn)，對(duì)相當(dāng)質(zhì)量濃度3.0 mg/mL的樣品進(jìn)行梯度分離。收集峰流出液，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，回收甲醇溶劑。所得產(chǎn)品用去離子水洗滌數(shù)次，真空干燥得橙皮苷精制品。

2.3 產(chǎn)品純度分析 分別將橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品、雙水相純化樣品及HPLC精制樣品配制成質(zhì)量濃度為20 μg/mL的溶液，用HPLC分析色譜對(duì)各樣品進(jìn)行分析，通過面積歸一化方法計(jì)算各出峰組分的百分比，近似看作各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。3種樣品的色譜如圖6—8所示。

根據(jù)圖6橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品的分析色譜圖，可知圖7中出峰時(shí)間7.380 min即第4個(gè)峰為橙皮苷，面積歸一化得面積分?jǐn)?shù)71.36%，即雙水相純化后的橙皮苷干樣品純度約為71.36%。

圖6 橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品分析圖譜Fig.6 HPLC chromatogram of the standard hesperidin

圖7 雙水相純化樣品分析圖譜Fig.7 HPLC chromatogram of purified hesperidin

圖8 HPLC精制品分析圖譜Fig.8 HPLC chromatogram of the refined hesperidin

圖8中保留時(shí)間7.375 min處的峰與橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（7.373 min）保留時(shí)間一致，歸一化面積分?jǐn)?shù)為96.09%，即制備型HPLC系統(tǒng)制備得到的橙皮苷干品純度約為96.09%。

制備型HPLC精制橙皮苷回收率

則橙皮苷總回收率

由雙水相純化樣品的分析圖譜可以看出，丙酮/K2HPO4體系對(duì)橙皮苷有一定的富集、純化作用。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品可知，除主要成分橙皮苷外，還有其他的一些雜質(zhì)存在。由于缺少對(duì)應(yīng)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，尚不能確定它們是哪種物質(zhì)。這有待于以后的進(jìn)一步研究。而經(jīng)制備色譜精制后的樣品已經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)峰值基本無異，說明制備色譜對(duì)于橙皮苷類物質(zhì)的純化十分有效。

3 結(jié)語

1）采用不同類型有機(jī)溶劑/無機(jī)鹽雙水相體系分離純化橙皮苷粗提物，效果不同。實(shí)驗(yàn)條件下，以丙酮/K2HPO4體系效果較好。其最佳萃取條件為：K2HPO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%；室溫，pH 10，粗提物用量0.4 g。其時(shí)，相比R為1.25，分配系數(shù)K為23.36，萃取回收率96.69%。

2）丙酮/K2HPO4雙水相萃取體系對(duì)橙皮苷有一定的選擇性，可達(dá)到70%以上的純度，純化倍數(shù)達(dá)20倍以上。但其選擇專一性還有待進(jìn)一步研究。

3）制備型HPLC的流動(dòng)相洗脫方式對(duì)橙皮苷的分離效果有一定影響。實(shí)驗(yàn)條件下，以甲醇-水梯度洗脫方式純化效果較好。

4）丙酮/K2HPO4雙水相體系純化后的橙皮苷樣品的純度約71.36%，制備型HPLC精制所得橙皮苷干品純度可達(dá)到96.09%，且回收率較高。

5）本實(shí)驗(yàn)橙皮苷總回收率約為83.54%。

6）由丙酮/K2HPO4構(gòu)成的雙水相體系選擇性較高，K2HPO4是生物活性物質(zhì)的常用緩沖溶液用藥品，由此構(gòu)成的雙水相體系更適合于具有生物活性的天然物質(zhì)的萃取分離，值得對(duì)此作進(jìn)一步研究。

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