軟骨仿生環(huán)境下的培養(yǎng)在軟骨組織工程中的研究進(jìn)展

袁禮波 綜述 徐永清 審校

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二〇醫(yī)院，云南 昆明 650032）

關(guān)節(jié)軟骨為透明軟骨，富有彈性，摩擦因數(shù)小，能吸收關(guān)節(jié)間振蕩，是維持關(guān)節(jié)功能的重要結(jié)構(gòu)，臨床上因多種原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨缺損的發(fā)病率很高，由于關(guān)節(jié)軟骨中無(wú)神經(jīng)、血管，自愈能力較差，因此，關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力有限，即使是小的關(guān)節(jié)軟骨損傷也可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退行性病變[1]。目前的治療方法如軟骨移植、微骨折等已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨的損傷修復(fù)[2]，但是，研究結(jié)果顯示，這些方法都存在一些技術(shù)上的局限性，均不能實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期的軟骨修復(fù)。此外，關(guān)節(jié)軟骨自我損傷的修復(fù)部位主要由纖維軟骨填充而不是透明軟骨，其最終結(jié)局還是修復(fù)部位軟骨的退化壞死，因此，組織工程在軟骨再生方面具有很大的發(fā)展?jié)摿Α６喾N種子細(xì)胞均可誘導(dǎo)出軟骨細(xì)胞，但在軟骨組織工程中，從正常組織中分離得到的種子細(xì)胞在不同的物理、化學(xué)等條件下，得到的細(xì)胞差異較大，主要表現(xiàn)在種子細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后與天然軟骨組織的匹配度、修復(fù)區(qū)力學(xué)強(qiáng)度不同等，這些復(fù)雜的因素均困擾著軟骨組織工程的發(fā)展和應(yīng)用。因此，歸納分析目前已知的各種對(duì)軟骨體外培養(yǎng)產(chǎn)生影響的因素，并展望一個(gè)行之有效的組合方法，通過(guò)仿生環(huán)境的研究進(jìn)一步推進(jìn)組織工程在軟骨修復(fù)研究中的發(fā)展方向。

一、種子細(xì)胞

軟骨組織工程的是將少量活組織作為種子細(xì)胞，將其體外培養(yǎng)擴(kuò)增后并植入病損部位，以達(dá)到損傷修復(fù)和功能重建的目的，其包括三大要素：成軟骨相關(guān)種子細(xì)胞、信號(hào)分子、支架材料等。

目前研究較多的種子細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、干細(xì)胞衍生的外泌體(stem cell-derived exosomes，SC-Exos)、脂肪干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞等,多種種子細(xì)胞均可誘導(dǎo)生成接近正常軟骨的細(xì)胞，但與培養(yǎng)過(guò)程中的多種因素相關(guān)，且差異較大。最新研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞并不是直接增殖、分化成軟骨組織，而更可能是通過(guò)旁分泌形式分泌細(xì)胞外囊泡的方式發(fā)揮功能，SC-Exos可以誘導(dǎo)周?chē)?xì)胞發(fā)生遺傳變化，并起調(diào)節(jié)作用，如促進(jìn)其增殖或抑制細(xì)胞凋亡。以上研究說(shuō)明，若SC-Exos在軟骨缺損部位保持其有效濃度，可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，從而持續(xù)有效地修復(fù)和再生軟骨組織。

二、生長(zhǎng)因子

探索出對(duì)細(xì)胞增殖有調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子已經(jīng)成為骨軟骨組織工程的重要環(huán)節(jié)。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子等在骨軟骨缺損的修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。其中，BMP-2成骨潛力巨大，是促進(jìn)骨骼再生的關(guān)鍵因素，An G等[6]制備明膠/聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid，PLGA)納米復(fù)合支架并將VEGF和BMP加載在支架中，使生長(zhǎng)因子在修復(fù)骨軟骨缺損可以持續(xù)釋放，結(jié)果顯示，VEGF和BMP可以促進(jìn)BMSCs在支架上的黏附、增殖和分化。趙丹丹等[7]獲取人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow-derived mesenchymal stem cells,hBMSCs）后，分別用DMEM和DMEM+堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF） 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。DMEM+bFGF培養(yǎng)體系下的細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞得率及成軟骨能力等方面均優(yōu)于DMEM組。DMEM+bFGF培養(yǎng)體系下，按照1∶3傳代的細(xì)胞傳至第6代仍能維持較好的細(xì)胞形態(tài)；第1～4代細(xì)胞均表達(dá)軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)Ⅱ型膠原，第5及后續(xù)代次的細(xì)胞成軟骨能力較差。此外，蔣萍等[8]發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原蛋白包被培養(yǎng)板在培養(yǎng)軟骨細(xì)胞時(shí)更能維持細(xì)胞形態(tài)，延長(zhǎng)去分化現(xiàn)象出現(xiàn)的時(shí)間，更利于細(xì)胞再分化?？到〉萚9]發(fā)現(xiàn)富血小板凝膠萃取液中 PDGF-AB、TGF-β1、IGF-1、VEGF 生長(zhǎng)因子濃度明顯高于全血，富血小板凝膠與軟骨細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)，軟骨細(xì)胞增殖速度明顯高于普通培養(yǎng)軟骨細(xì)胞。由此可見(jiàn)在體內(nèi)，細(xì)胞的新陳代謝和功能的發(fā)揮時(shí)刻受到來(lái)自微環(huán)境的信息調(diào)控，包括來(lái)自周?chē)?xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)或因子中的生化信息、生物力學(xué)和生物電刺激信號(hào)等[10]，因此出現(xiàn)了共培養(yǎng)的概念，其初衷是在體外環(huán)境下模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞間信息交換和功能仿生組織的生成，但是，軟骨組織工程共培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞間相互作用的具體機(jī)制仍不清楚。介于多種生長(zhǎng)因子的不同作用機(jī)理，可認(rèn)為只應(yīng)用一種或少數(shù)生長(zhǎng)因子往往達(dá)不到多方位同時(shí)促進(jìn)軟骨向正常軟骨生長(zhǎng)的目的，只有不斷模仿正常生物的體內(nèi)環(huán)境，才能增加軟骨體外培養(yǎng)的滿意度。

三、載體

目前用于組織工程支架的材料主要有天然生物材料、人工合成高分子材料和復(fù)合材料3大類。單純應(yīng)用天然生物材料或人工合成高分子材料存在諸多問(wèn)題，如生物力學(xué)不足及免疫反應(yīng)等；將兩種或兩種以上具有互補(bǔ)特性的材料進(jìn)行復(fù)合，并選擇合適的制備工藝，可以設(shè)計(jì)構(gòu)造出能夠滿足軟骨組織工程所需的三維支架。而三維支架的研究仍處于初級(jí)階段，從已有研究文獻(xiàn)報(bào)道的支架類型從結(jié)構(gòu)上大致分為以下三類，單相支架、雙相支架、復(fù)合多相一體化支架。其中骨-軟骨一體化的單相支架又可同時(shí)修復(fù)軟骨與軟骨下骨，如段平國(guó)等[11]用一體化雙層聚乳酸/羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)多孔支架材料，采用室溫模壓/粒子浸出法制備一體化雙層多孔支架，8周后見(jiàn)支架上層纖維組織中夾雜有少量軟骨細(xì)胞，下層可見(jiàn)大量骨小梁樣組織形成，上下層組織緊密結(jié)合，支架部分降解。鹿亮等[12]用豬軟骨細(xì)胞接種至脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)（acellular cartilage extra cellular matrix，ACECM） 取向支架，體外構(gòu)建組織工程軟骨，再將軟骨細(xì)胞-支架復(fù)合物植入裸鼠背部皮下腔隙，術(shù)后4周，大體觀察見(jiàn)復(fù)合物呈類軟骨樣組織，組織學(xué)染色及Ⅱ型膠原免疫組織化學(xué)染色示細(xì)胞周?chē)浌羌?xì)胞外基質(zhì)分泌，可見(jiàn)ACECM取向支架有利于軟骨細(xì)胞的黏附、增殖及取向性分布類似于正常軟骨結(jié)構(gòu)，并在裸鼠皮下成功異位構(gòu)建組織工程軟骨。鄧天政等[13]制備了明膠-硫酸軟骨素-透明質(zhì)酸及明膠-陶瓷化骨-軟骨復(fù)合多相支架，發(fā)現(xiàn)兔軟骨細(xì)胞在復(fù)合支架上生長(zhǎng)良好，但該方法的不足是其產(chǎn)生的微孔大小難以控制。Yang X等[14]將氧化的海藻酸鹽作為大分子交聯(lián)劑制備膠原水凝膠支架，結(jié)果顯示乳兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在交聯(lián)的膠原水凝膠支架上生長(zhǎng)良好，并保持細(xì)胞表型，但該技術(shù)的不足是所制備的支架強(qiáng)度不高，并且常因吸水而變形，不能很好地促進(jìn)細(xì)胞增殖。李建偉等[15]以豬源脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)、納米級(jí)羥基磷灰石和海藻酸鈉為原材料，按不同成分比例混合，利用冷凍干燥技術(shù)和物理化學(xué)法交聯(lián)，制備出以脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)為軟骨層，海藻酸鈉和脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)為中間層，納米級(jí)羥基磷灰石、海藻酸鈉和脫細(xì)胞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)為骨層的骨軟骨一體化多相支架，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該骨-軟骨一體化多相支架具有良好的生物學(xué)與力學(xué)特性，但需要進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察修復(fù)效果。這些相對(duì)傳統(tǒng)的方法在制備由多種材料不同結(jié)構(gòu)的各相層組成的非均相支架方面仍存在缺陷。近年來(lái)，采用3D打印技術(shù)制備多孔隙支架已成為研究熱門(mén)，3D打印可精確定制外形和尺寸符合需要的植入體。運(yùn)用3D打印技術(shù)制備的支架材料，不僅外形可控，其內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)、大小、分布亦簡(jiǎn)單易調(diào)，而且支架材料的組合自由多樣，可以實(shí)現(xiàn)骨與軟骨組織在結(jié)構(gòu)和組份上的高度模擬。此外，3D生物打印技術(shù)也帶來(lái)了組織工程領(lǐng)域內(nèi)新的一場(chǎng)技術(shù)革命，能夠?qū)⒓?xì)胞和生物材料作為生物打印墨水，精確復(fù)制目標(biāo)組織生理結(jié)構(gòu)。

四、其他影響因素

在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間范圍內(nèi)施以適當(dāng)?shù)膲毫梢源龠M(jìn)單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)的分泌，而超過(guò)一定的限度則會(huì)產(chǎn)生抑制的作用。Falsafi S等[16]研究發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞在微重力狀態(tài)下能迅速增殖，在短時(shí)間內(nèi)分裂達(dá)較高的數(shù)量級(jí)別，克服了常規(guī)的培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、增殖慢的缺點(diǎn)。氣體環(huán)境對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的影響早就被人們所認(rèn)識(shí)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)時(shí)也不例外。趙螢等[17]采用成軟骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)同時(shí)每天給予120kPa壓力刺激1h，4周后采用Electro Force systems 3200力學(xué)測(cè)量?jī)x測(cè)量其彈性模量，發(fā)現(xiàn)壓力作用下的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)復(fù)合富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)雙膜復(fù)合體所構(gòu)建的組織工程軟骨其彈性模量較其他組更接近天然軟骨。此外，使用外源性機(jī)械壓力作用于移植的軟骨細(xì)胞及其基質(zhì)，可以使用靜水壓力[18]和動(dòng)態(tài)壓縮[19]方法改善基質(zhì)成熟和新組織功能。但人在步行過(guò)程中，作用于人膝蓋軟骨的壓力是人體質(zhì)量的4～5倍，而軟骨細(xì)胞是通過(guò)增殖和產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)高機(jī)械負(fù)荷。因此軟骨組織工程中關(guān)鍵之一在于找到合適的力學(xué)載荷;既要滿足組織代謝和傳質(zhì)的要求;又要模擬關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng),對(duì)軟骨產(chǎn)生適當(dāng)?shù)?、耦合的力學(xué)載荷和生化刺激,促進(jìn)工程軟骨的功能化構(gòu)建，有研究發(fā)現(xiàn)氧濃度過(guò)高、過(guò)低都不利于軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖及代謝，但具體氧濃度高低難以提出具體的數(shù)值，總而言之，僅僅提供這些條件尚未能滿足軟骨細(xì)胞維持正常生長(zhǎng)的需求[20]，因?yàn)楦饕蛩貙?duì)組織工程軟骨生物學(xué)效應(yīng)的具體機(jī)制仍不清楚，因此體外仿生環(huán)境下模擬體內(nèi)細(xì)胞微循環(huán)的培養(yǎng)系統(tǒng)的提出，是需要不斷深入的研究方向。

五、總結(jié)

在組織工程軟骨體外培養(yǎng)過(guò)程中，種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與代謝產(chǎn)物、溫度、酸堿環(huán)境、氧分壓、CO2濃度等各種生化因素的變化都會(huì)造成培養(yǎng)條件的改變，進(jìn)而影響軟骨體外構(gòu)建的結(jié)果，而這些理化條件、應(yīng)力及支架材料等各因素之間又相互聯(lián)系，相互影響，共同作用于工程軟骨，因此，在軟骨組織工程體外構(gòu)建過(guò)程中需要充分考慮各因素之間的關(guān)系，包括力學(xué)載荷、生化刺激之間的協(xié)同作用或拮抗作用等，以進(jìn)一步營(yíng)造仿生培養(yǎng)環(huán)境。