未免疫乳鴿嗉囊鴿乳和血清中新城疫病毒抗體的檢測(cè)

◆作者：杜新府劉保國(guó)杭柏林,3陳文杰黃俊杰寧春妹

◆單位：1.河南省葉縣畜牧局；2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院；3.教育部禽類(lèi)預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江蘇省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院

新城疫（Newcastle disease）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的鴿的一種重要的病毒性傳染病，對(duì)養(yǎng)鴿業(yè)危害甚大。常常使用疫苗來(lái)預(yù)防鴿新城疫的發(fā)生。種鴿免疫后，新城疫抗體可通過(guò)卵黃進(jìn)入乳鴿體內(nèi)，成為母源抗體。了解雛雞血清中新城疫病毒母源抗體的變化有利于幫助確定新城疫病毒疫苗的初次免疫時(shí)間，而這一原理也同樣適用于乳鴿。鴿乳（Pigeon milk）是哺育期親鴿嗉囊分泌的用來(lái)喂養(yǎng)乳鴿的營(yíng)養(yǎng)液，主要成分是蛋白質(zhì)和脂肪，包括IgG、IgA和IgY等免疫球蛋白，對(duì)乳鴿的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。但是，目前尚不清楚新城疫病毒疫苗免疫親鴿分泌的鴿乳進(jìn)入乳鴿嗉囊后是否還有新城疫病毒的抗體。因此，本研究主要檢測(cè)了新城疫病毒疫苗免疫親鴿所哺育乳鴿血清和嗉囊鴿乳中的新城疫病毒抗體，分析了其變化規(guī)律及其相關(guān)性，以期為生產(chǎn)實(shí)踐提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)鴿

試驗(yàn)用乳鴿來(lái)自河南淇縣某鴿場(chǎng)，出殼后沒(méi)有用任何疫苗免疫。親鴿在配對(duì)前用新城疫病毒（Ulster 2C株）滅活苗進(jìn)行飲水免疫，自由采食、飲水，采用“2+4”的方式哺育乳鴿。

1.2 試劑與儀器

新城疫病毒（La Sota株）弱毒疫苗購(gòu)自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，新城疫病毒(Ulster 2C株)滅活苗購(gòu)自南京梅里亞動(dòng)物保健有限公司。氯化鈉購(gòu)自天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，碘酊購(gòu)自德州欣瑞達(dá)消毒制品有限公司，醫(yī)用酒精購(gòu)自洛陽(yáng)市潔康消毒劑廠，氯仿購(gòu)自洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司，檸檬酸鈉購(gòu)自天津市北辰方正試劑廠，其它為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

離心機(jī)（型號(hào)為80-2）購(gòu)自上海手術(shù)器械廠，高壓滅菌器（型號(hào)為L(zhǎng)DZX-30KAS）購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠，移液器（型號(hào)為Reserch plus）購(gòu)自德國(guó)Eppendorf股份有限公司，生化培養(yǎng)箱（型號(hào)為GNP-9270）購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，天平（型號(hào)為HC-C）購(gòu)自慈溪市華徐衡器實(shí)業(yè)有限公司，冰箱（型號(hào)為 BCD-610W(KA92NV02TI)）購(gòu)自波西化電器(安徽)有限公司。

1.3 鴿血清和鴿乳的采集

用一次性注射器從乳鴿的心臟中采集血液，4000 r/min離心 10min，收集血清，4℃保存，待測(cè)，1日齡17份樣品，5日齡10日齡各10份樣品。將乳鴿嗉囊部用碘酊、酒精消毒，用無(wú)菌剪刀剪開(kāi)嗉囊，用一次性注射器吸取鴿乳，1日齡、5日齡和10日齡各10份樣品。

1.4 鴿乳中抗體的提取

鴿乳中抗體的提取按照文獻(xiàn)的方法進(jìn)行。取1mL鴿乳與1mL生理鹽水，充分震蕩混合1min，然后加入2mL氯仿，充分震蕩混合2min，室溫中靜置1h，4000 轉(zhuǎn) /分鐘離心 10min，收集上清，4℃保存，待測(cè)。

1.5 1%雞紅細(xì)胞的制備

健康公雞血液（3.8%檸檬酸鈉抗凝）采集自新鄉(xiāng)市洪門(mén)鎮(zhèn)菜市場(chǎng)。按照文獻(xiàn)（杭柏林等，2017）的方法制備1%雞紅細(xì)胞懸液，4℃保存，備用。

1.6 血凝和血凝抑制試驗(yàn)

血凝和血凝抑制試驗(yàn)采用微量法進(jìn)行，具體操作按照文獻(xiàn)（杭柏林等，2017）的方法進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

用GraphPad Prism軟件進(jìn)行繪圖，并進(jìn)行t-test和相關(guān)性分析（two-tailed，95%confidence）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 未免疫乳鴿血清中新城疫病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

未免疫乳鴿血清中新城疫病毒抗體的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，隨著日齡的增加，抗體水平呈逐漸下降的趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。這表明，未免疫乳鴿從出殼開(kāi)始，血清中的新城疫病毒抗體逐漸下降，但下降趨勢(shì)較緩。

圖1 鴿血清中新城疫抗體檢測(cè)結(jié)果

2.2 未免疫乳鴿嗉囊鴿乳中新城疫病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

未免疫乳鴿鴿乳中新城疫病毒抗體的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，隨著日齡的增加，鴿乳中新城疫病毒抗體呈顯著性下降（P＜0.05），第 5日齡時(shí)絕大數(shù)檢測(cè)鴿的鴿乳已經(jīng)沒(méi)有新城疫病毒的抗體，第10日齡時(shí)所有檢測(cè)鴿的鴿乳中已經(jīng)沒(méi)有新城疫病毒抗體了。這表明鴿乳中新城疫病毒抗體水平隨日齡增加下降極快。

圖2 鴿乳中新城疫抗體檢測(cè)結(jié)果

2.3 血清和嗉囊鴿乳中新城疫病毒抗體的相關(guān)性

經(jīng)分析，1日齡、5日齡和10日齡時(shí)血清和嗉囊鴿乳中新城疫病毒抗體水平?jīng)]有相關(guān)性（P＞0.05）。

3 討論

乳鴿出殼后體內(nèi)新城疫病毒母源抗體水平高低影響到機(jī)體對(duì)新城疫病毒的抵抗力。姚月華等（2005）認(rèn)為，新城疫病毒疫苗免疫次數(shù)少的種鴿血清中含有的新城疫病毒血凝抑制（HI）抗體水平低，所產(chǎn)乳鴿血清中含有的新城疫病毒母源HI抗體水平就更低，常不足以提供保護(hù)，使得乳鴿易發(fā)生新城疫。在本研究中，1日齡乳鴿血清中新城疫病毒HI抗體平均水平(5.059 log2)高于4log2，但5日齡時(shí)乳鴿血清中新城疫病毒HI抗體平均水平(4.2 log2)非常接近于4log2，到10日齡時(shí)乳鴿血清中新城疫病毒HI抗體平均水平 (3.8 log2)已經(jīng)低于4log2。因此，推薦該鴿場(chǎng)的乳鴿應(yīng)在3-5日齡時(shí)進(jìn)行新城疫病毒疫苗的免疫。

親鴿所產(chǎn)生抗體可通過(guò)卵黃傳遞給子代。Ahmad等（2013）用鑰孔戚血藍(lán)素（KLH）免疫母鴿，在子代鴿血清中檢測(cè)到了抗KLH的抗體，并隨著日齡增加，抗體水平逐漸下降，但認(rèn)為親鴿嗉囊鴿乳中不含有抗體或不含有能通過(guò)胃屏障到達(dá)血流的抗體，因其測(cè)定的抗體類(lèi)型是IgY，不是IgA。有研究認(rèn)為，在鴿乳中檢測(cè)不到抗KLH的IgY。鴿乳中的IgA在乳鴿胃部有重要的保護(hù)作用，并能部分到達(dá)血流。但嗉囊鴿乳中的抗體不影響乳鴿血清中抗體的消長(zhǎng)規(guī)律。在本研究中，各日齡時(shí)血清和嗉囊鴿乳中新城疫病毒的HI抗體之間沒(méi)有相關(guān)性。這表明，嗉囊鴿乳中的抗體對(duì)血清中的抗體水平?jīng)]有影響。然而，1日齡時(shí)絕大多數(shù)鴿嗉囊鴿乳中檢測(cè)到新城疫病毒血凝抑制（HI）抗體，5日齡時(shí)僅個(gè)別鴿嗉囊鴿乳中檢測(cè)到新城疫病毒（HI）抗體，而到10日齡時(shí)鴿嗉囊鴿乳中檢測(cè)不到HI抗體?？贵w逐漸降低或檢測(cè)不到的可能原因是，隨著日齡增加，親鴿鴿乳中新城疫病毒HI抗體的分泌量逐漸減少，或者是乳鴿嗉囊中的微生物的種類(lèi)和數(shù)量越來(lái)越多，將新城疫病毒HI抗體降解了。但究竟是何原因，還需要深入探討。

4 小結(jié)

隨日齡增加，未免疫乳鴿血清中新城疫抗體水平下降速度較緩，而嗉囊鴿乳中新城疫抗體水平極具下降，血清和嗉囊鴿乳中的新城疫抗體水平?jīng)]有相關(guān)性。