7例犬子宮蓄膿病例的病原菌分離鑒定

陳詩涵，魏潤宇，李軍朝，管飄萍，黃紫貝，王彥紅，張信軍，王海燕，劉文博

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009；2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300）

犬作為伴侶動物，深受人們的喜愛，但隨著年齡的增長，易發(fā)生多種疾病。中老齡母犬特別是老齡未育犬易發(fā)生子宮蓄膿，一般多發(fā)生于未生育且年齡超過6歲的中老齡母犬[1]。Tsumagari 等[2]認(rèn)為，子宮蓄膿一般發(fā)生于犬發(fā)情后期，因為這一階段雌激素分泌減少，孕酮作用逐漸增強(qiáng)，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜囊發(fā)生泡性增生，腺體分泌大量液體，使生殖道抵抗力降低，繼而引發(fā)細(xì)菌感染[3]。因此，犬子宮蓄膿通常是由于內(nèi)分泌紊亂和細(xì)菌感染共同引起的。此外，周圍組織炎癥的繼發(fā)感染、產(chǎn)后感染、交配感染和機(jī)械刺激等也能引發(fā)該病。

犬患病時主要臨床表現(xiàn)為體溫升高、精神沉郁、食欲減退、飲欲增加、多尿、嘔吐、腹圍增大等[4]。根據(jù)子宮頸開放與否，子宮蓄膿又分為開放型和閉合型，前者會從陰道中排出膿性或血性分泌物。在子宮蓄膿發(fā)生過程中，細(xì)菌起到了推波助瀾的作用。因此，明確子宮蓄膿病原菌情況，有助于子宮蓄膿的治療。

本研究對來自江蘇省揚(yáng)州市動物醫(yī)院的7例犬子宮蓄膿病例進(jìn)行了整理分析。這7例病例在7～10歲之間，多數(shù)曾有過發(fā)情史，表現(xiàn)精神不振、食欲不佳、腹脹等癥狀，體溫大多超過38 ℃。經(jīng)臨床檢查，包括B 超檢查、血常規(guī)檢查、血液生化檢查等，確診為子宮蓄膿，大多為開放型。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要儀器包括：一次性注射器、SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺、接種環(huán)、接種棒、指形管、4 ℃冰箱、-20 ℃冰箱、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、光學(xué)顯微鏡、不同量程移液器、PCR 熱循環(huán)儀等；主要試劑包括：血瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基、革蘭氏染液、16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（TaKaRa）、腸桿菌科生化鑒定試劑、生化反應(yīng)管（杭州微生物試劑有限公司）。測序由南京金斯瑞公司進(jìn)行。

1.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

用一次性無菌注射器收集病例子宮內(nèi)容物，作好標(biāo)記。取病料無菌操作接種于血瓊脂平板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中1～2 d，觀察菌落形狀、大小、顏色，觀察是否為單一菌株；若為混合株，挑選單個菌落純化，記錄不同菌株菌落形態(tài)；再次將單個菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基觀察菌落形態(tài)。

1.3 革蘭氏染色鏡檢

分別對不同菌株進(jìn)行革蘭氏染色，進(jìn)行革蘭氏陽性、陰性菌鑒定。

1.4 生化試驗

將上述分離純化出的菌株，用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管進(jìn)行生化指標(biāo)檢測，置于37 ℃培養(yǎng)箱1 d，觀察結(jié)果。

1.5 16S rDNA 細(xì)菌鑒定

取無菌1.5 mL 指形管，加入1 mL 含4%血清的LB 培養(yǎng)基；挑選單個菌落加入培養(yǎng)基，37 ℃搖菌14～16 h，100 ℃煮沸10 min，12 000 r/min離心2 min，取上清作為DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；使用16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 試劑盒（TaKaRa 公司）對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，將目的條帶切膠送南京金斯瑞公司測序。PCR 體系共25 μL：DNA 模板2 μL、DDW（雙蒸水）10 μL、PCR Premix（PCR 預(yù)混劑）12.5 μL、上游引物0.25 μL、下游引物0.25 μL；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

2 結(jié)果

2.1 菌落特征

1號、3號在麥康凱平板上呈粉紅色的圓形菌落，疑似大腸桿菌（圖1）；2號、4號在血平板上呈光滑的圓形菌落，疑似腸桿菌科（圖2）；5號、6號在血平板為半透明的圓形菌落，疑似銅綠假單胞菌（圖3）；7號在血平板上呈灰色、光滑的圓形菌落，疑似大腸桿菌（圖4）。

圖1 麥康凱培養(yǎng)基1號菌

圖2 血平板2號菌

圖3 血平板6號菌

圖4 血平板7號菌

2.2 染色鏡檢

染色鏡檢結(jié)果顯示，2號是革蘭氏陽性球菌，疑似糞腸球菌（圖5），其他均是革蘭氏陰性桿菌，疑似大腸桿菌（圖6）。

圖5 革蘭氏陽性球菌

圖6 革蘭氏陰性桿菌

2.3 生化鑒定

生化鑒定結(jié)果顯示：1號、3號、7號分離細(xì)菌生化特性完全符合大腸桿菌特征，4-1、4-2號不完全符合大腸桿菌生化特性，但符合腸桿菌科特性；2號分離細(xì)菌生化特性與糞腸球菌相符，5號分離細(xì)菌生化特性基本符合產(chǎn)酸克雷伯菌的生化特性，6-1、6-2、6-3號菌生化特性基本符合銅綠假單胞菌的特征。具體結(jié)果見表1。

2.4 16S rDNA 細(xì)菌鑒定

鑒定結(jié)果顯示：本試驗分離得到的細(xì)菌主要是革蘭氏陰性桿菌，其中腸桿菌科占大多數(shù)，另有1株克雷伯菌和4株球菌（1株糞腸球菌和3株銅綠假單胞菌）。具體結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 病原菌

致病菌受環(huán)境影響較大，因此不同地區(qū)子宮蓄膿致病菌的種類可能不盡相同，有時也分離不出細(xì)菌。分離不出細(xì)菌的原因可能是子宮本身具有防御機(jī)能，也可能是進(jìn)行了抗菌治療，而致病菌又對抗菌藥極其敏感[5]。本試驗從7例病例中分離到10株菌株，其中大腸桿菌3株、銅綠假單胞菌3株、產(chǎn)氣腸桿菌2株，以及糞腸球菌和產(chǎn)酸克雷伯菌各1株，說明江蘇省揚(yáng)州市子宮蓄膿的致病菌種類較多。因此，在治療本病時，要進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，根據(jù)致病菌種類和藥敏試驗，選擇敏感藥物進(jìn)行治療。

表1 細(xì)菌生化特性鑒定結(jié)果

表2 16S rDNA 細(xì)菌鑒定結(jié)果

3.2 預(yù)防與治療

母犬早做絕育手術(shù)，能有效預(yù)防子宮蓄膿的發(fā)生。配種時，注意外生殖器衛(wèi)生，避免細(xì)菌感染；子宮周圍組織有炎癥時，要及時治療，防止繼發(fā)感染[6]。平時也要關(guān)注犬的健康，定期對其進(jìn)行體檢，包括血常規(guī)、生化和影像學(xué)檢查，盡早發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)和細(xì)菌感染。

患犬在術(shù)后仍需進(jìn)行全身的抗生素治療，以消除體內(nèi)炎性反應(yīng)和潛在的術(shù)后感染。部分患犬在術(shù)前就診斷出伴發(fā)腹膜炎等全身性炎癥反應(yīng)，因此需要在術(shù)后恢復(fù)期，定期監(jiān)測血液指標(biāo)，并根據(jù)數(shù)據(jù)變化及時調(diào)整治療方案。

犬子宮蓄膿病例常發(fā)生炎癥反應(yīng)和細(xì)菌感染，導(dǎo)致白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞明顯增多[7]。因此在藥物治療時，如果血常規(guī)檢驗發(fā)現(xiàn)患犬出現(xiàn)核左移數(shù)據(jù)變化時，提示預(yù)后良好；當(dāng)單核細(xì)胞數(shù)目明顯增多時，表明疾病處于急性感染后期[8]。這對后期的診療有一定幫助。

犬子宮蓄膿病例在藥物治療期間，其肝腎并發(fā)癥出現(xiàn)的頻率較高，因此在治療細(xì)菌感染過程中，要進(jìn)行血液生化檢驗，注意肝腎指標(biāo)變化，依此判斷肝腎損傷程度，以便制定合理治療措施以恢復(fù)肝腎功能，并保證預(yù)后。

目前在國外正在流行使用一些激素類藥物治療子宮蓄膿，其中使用較多的是多巴胺激動劑和孕酮受體阻滯劑。其原理是阻止孕激素的產(chǎn)生或使孕激素?zé)o法在體內(nèi)產(chǎn)生作用[9]。在我國，并未有寵物專用的此類藥。對于此類藥物的研發(fā)，仍需要開展大量試驗性研究和臨床應(yīng)用觀察。

3.3 試驗的局限性與意義

本試驗由于病例較少，不能詳細(xì)分析導(dǎo)致子宮蓄膿病原菌的所有種類，以及病原菌種類分布的概率或者是其他地緣性因素的影響，但病原菌分離鑒定結(jié)果，可為臨床上子宮蓄膿的治療提供一定依據(jù)。后續(xù)需開展病原菌的藥敏試驗，為該地區(qū)犬子宮蓄膿治療藥物的選擇提供參考。