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    羊傳染性膿皰病毒NZ2毒株CBP 蛋白結構分析與表位預測

    2019-12-06 10:18:00成偉偉陳伯祥常攀峰趙子惠
    中國動物檢疫 2019年12期
    關鍵詞:預測出信號肽表位

    成偉偉,陳伯祥,常攀峰,楊 明,趙子惠

    (甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平涼 744000)

    羊傳染性膿皰是由羊傳染性膿皰病毒(ORFV)感染山羊和綿羊,在其嘴唇部皮膚形成膿皰或結成厚痂的一種人獸共患傳染病[1]。該病主要在3月齡左右的羔羊和部分免疫力下降的成年羊中流行,可導致感染羔羊死亡、成年羊生產性能下降[2]。該病也可感染人,使人的手部皮膚出現(xiàn)潰瘍甚至壞死[3-4]。因而該病既影響?zhàn)B羊業(yè)健康發(fā)展,也威脅人們身體健康。

    ORFV 的ORF112基因編碼的CBP 蛋白是趨化因子結合蛋白,含有286個氨基酸殘基[5]。ORF112基因長約861 bp。CBP 蛋白能夠競爭性地結合趨化因子,阻止G 蛋白偶聯(lián)受體與趨化因子結合,從而抑制宿主的免疫反應。有研究[6]表明,敲除ORF112基因,對ORFV 的致病性有明顯影響。然而其具體機制并不清楚,CBP 蛋白是否還具有其他功能也不清楚。所以,本研究以ORFV NZ2毒株的CBP 蛋白氨基酸序列為研究對象,應用生物信息學方法,對CBP 蛋白的理化特性、親水性、跨膜區(qū)、信號肽、二級結構、三級結構、B 細胞表位和T 細胞表位進行預測分析,以期為CBP 蛋白的功能研究和ORFV 的致病機制研究提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 氨基酸序列

    選 取GenBank 中ORFV NZ2毒株的CBP 基因序列(序列號為ABA00630),運用Editseq 軟件翻譯成CBP 蛋白的氨基酸序列,序列如下:

    1.2 方法

    運用在線工具ProtParam,分析CBP 蛋白的理化特性[7];利用DNAstar 軟件中的KyteDolittle方法,預測CBP 蛋白的親水性和疏水性;利用在線軟件TMHMM 和SingnalIP,預測CBP 蛋白的跨膜區(qū)和信號肽[8];利用DNAstar 軟件,預測分析CBP 蛋白的二級結構[9-10];將CBP 蛋白的氨基酸序列提交Swiss-Model,使用RasMol 分析軟件構建OVIFNR 蛋白的三級結構模型[11];運用在線ABCpred 工具和DNAstar 軟件,預測CBP 蛋白B細胞表位[12-13],并綜合分析單參數(shù)預測結果,篩選出優(yōu)勢B 細胞表位;分別運用在線服務器nHLAPred 和在線軟件SYFPEITHII,預測CBP 蛋白所含的HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203三種MHC-I 結合肽段,并結合兩種方法預測出的結果,篩選出優(yōu)勢CTL 表位[14];分別使用在線服務器ProPred 和在線軟件SYFPEITHI,預測CBP 蛋白所含的HLA-DRB1*0101、HLADRB1*0102、HLA-DRB1*0301三種MHC-II 結合肽段,然后結合兩種方法預測出的結果,篩選出優(yōu)勢Th 表位[15]。

    2 結果

    2.1 CBP 蛋白的理化特性預測分析

    CBP 蛋白的理化特性預測分析結果顯示,CBP 蛋白的分子式為C1357H2155N367O451S11,相對分子質量為31.179 89 kDa,理論等電點為4.68,半衰期為30 h,穩(wěn)定系數(shù)為43.06,脂肪族指數(shù)為81.78,總平均親水性為-0.383。

    2.2 CBP 蛋白的親疏水性預測分析

    CBP 蛋白的親水性和疏水性預測結果(圖1)顯示,CBP 為親水性蛋白,其親水性區(qū)域主要位于19~62、71~90、119~125、132~158、165~184、188~220、242~290位氨基酸區(qū)域。

    2.3 CBP 蛋白的跨膜區(qū)和信號肽預測分析

    圖1 CBP 蛋白親水性預測結果

    CBP 蛋白的跨膜區(qū)預測結果(圖2)顯示,CBP 蛋白無跨膜區(qū),其1~286個氨基酸殘基全部在膜外。CBP 蛋白信號肽預測結果(圖3)顯示,CBP 蛋白存在潛在的信號肽,位于1~15位氨基酸殘基處,在16~17位處存在剪切位點。

    2.4 CBP 蛋白的二三級結構預測分析

    圖2 CBP 蛋白跨膜區(qū)預測結果

    圖3 CBP 蛋白信號肽預測結果

    CBP 蛋白的二級結構的預測結果(圖4)顯示:CBP 蛋白的二級結構中主要包括α 螺旋、β 折疊、β 轉角和無規(guī)卷曲4種類型,所占比重分別為α 螺旋38.11%、β 折疊33.91%、β 轉角5.94%、無規(guī)卷曲10.48%;CBP 蛋白的α 螺旋主要位于1~24、27~35、39~48、67~95、155~163、235~245、251~253、260~273,β 折疊主要位于49~57、63~66、96~114、122~131、136~143、151~154、182~189、206~212、217~227、229~234、246~250、276~281,β 轉角主要位于58~61、146~148、166~169、175~177、198~200,無規(guī)卷曲主要位 于36~38、117~121、132~134、170~172、178~181、190~195、201~203、282~284。使用在線軟件Swiss-Model 構建的CBP 蛋白三級結構模型如圖5所示。

    圖4 CBP 蛋白二級結構預測結果

    圖5 CBP 蛋白三級結構同源建模

    2.5 CBP 蛋白的B 細胞表位預測分析

    利用DNAstar 軟件對CBP 蛋白的柔性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性進行預測,結果如圖6所示;運用在線軟件ABCpred 預測CBP 蛋白B 細胞表位,結果如表1所示。將β 轉角、無規(guī)卷曲、親水性區(qū)域、柔韌性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性區(qū)域的預測結果作為CBP 蛋白B 細胞表位預測的參數(shù),結合ABCpred 預測結果,綜合篩選出CBP 蛋白優(yōu)勢B 細胞表位,結果篩選出CBP 蛋白優(yōu)勢B 細胞表位6個,分別是17~27、21~31、74~84、81~91、118~128、132~142(表2)。

    2.6 CBP 蛋白的T 細胞表位預測分析

    圖6 CBP 蛋白的柔韌性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性預測結果

    表1 ABCpred 預測CBP 蛋白B 細胞表位

    運用在線服務器nHLA-Pred 對CBP 蛋白所含的HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203三種MHC-I 結合肽段的預測結果見表3,利用在線軟件SYFPEITHII 對CBP 蛋白CTL 表位進行預測,預測結果見表4。結合兩種方法的預測結果,篩選出CBP 蛋白的3個優(yōu)勢CTL 表 位,分別為4~13位 的VLLLALLGA、65~74位 的CMLDIEDSV 和120~129位 的SLEDSYLYV。

    表2 綜合篩選CBP 蛋白優(yōu)勢B 細胞表位

    使用在線服務器ProPred 預測CBP 蛋白HLA-DRB1*0101、HLA-DRB1*0102和HLADRB1*0301三種MHC-II 結合肽段,未預測出MHC-II 結合肽段;運用在線軟件SYFPEITHI 預測CBP 蛋白的MHC-II 結合肽段,也未預測出MHC-II結合肽段。兩種預測的結果表明,CBP 蛋白可能不含Th 細胞表位。

    表3 nHLA-Pred 方法對CBP 蛋白CTL 表位的預測結果

    表4 SYFPEITHI 方法對CBP 蛋白CTL 表位預測

    3 討論

    通過生物信息學軟件預測出CBP 蛋白的理論等電點為4.68。蛋白質所處環(huán)境的pH 大于理論等電點時,蛋白質帶負電,小于理論等電點時,蛋白質帶正電[16-17]。而CBP 蛋白在ORFV 感染宿主的早期表達中,宿主體內的pH 約為7.0左右,所以該蛋白在宿主體內帶負電;該蛋白的穩(wěn)定系數(shù)為43.06,說明該蛋白不太穩(wěn)定。蛋白質的穩(wěn)定性與其特定的氨基酸序列、剪切加工及空間結構都有密切的關系。蛋白質是否為親水性蛋白主要取決于其分子表面的電荷量。CBP 蛋白雖為親水性蛋白,但較強的親水性區(qū)域較少,說明該蛋白形成抗原表位方面的能力不足。在線軟件SingnalIP 預測結果表明,CBP 蛋白存在潛在的信號肽,有信號肽的蛋白大多被分泌到膜外發(fā)揮作用;而在線軟件TMHMM 預測結果表明,CBP 蛋白無跨膜區(qū),1~286個氨基酸殘基全部在膜外。這兩種預測結果充分說明,CBP 蛋白被運輸?shù)侥ね獍l(fā)揮作用。

    CBP 蛋白的二級結構預測表明,β 轉角和無規(guī)卷曲所占比重較小,說明該蛋白不易形成抗原表位;而CBP 蛋白的表位預測結果也說明了這一點,CBP 蛋白預測出的細胞表位較少。Swiss-Model 是基于同源建模的方法構建蛋白質三級結構,是目前三級結構預測中最好的預測工具之一,構建出的三級結構具有更高的準確性。蛋白質三維結構的構建有助于對蛋白質功能的認識。本研究構建的CBP蛋白的三維結構形似倒立的啞鈴狀,上下兩部分比較對稱。本研究在CBP 蛋白B 細胞表位預測方面,將β 轉角、無規(guī)卷曲、親水性區(qū)域、柔韌性區(qū)域、抗原指數(shù)和表面可及性區(qū)域的預測結果作為參數(shù),并結合 ABCpred 預測結果篩選CBP 蛋白的B 細胞表位,這樣篩選出的CBP 蛋白B 細胞表位具有更高的可信度。在CTL 細胞表位預測方面,結合了nHLA-Pred 和SYFPEITHII 兩種方法預測的結果,在Th 細胞表位預測方面,結合了ProPred 和SYFPEITHII 兩種方法預測的結果,所以預測出的CBP 蛋白T 細胞表位具有更高的可靠性。本研究篩選出CBP 蛋白優(yōu)勢B 細胞表位6個、CTL 細胞表位3個,未預測出Th 細胞表位。這樣CBP 蛋白較少的細胞表位與CBP 蛋白二級結構中β 轉角和無規(guī)卷曲所占比重較小相互印證。本研究在B 細胞表位預測上與黎攝兒等[18]對ORFV 湖北分離株的CBP 蛋白B 細胞表位預測結果基本一致,但在T 細胞表位預測上差異較大。這可能與ORFV 各毒株間的差異有關。CBP 蛋白未預測出Th 細胞表位,說明該蛋白可能在ORFV 逃避宿主免疫反應過程中發(fā)揮了作用。

    本研究僅運用生物信息學方法對ORFV NZ2毒株CBP蛋白的結構與細胞表位進行了分析預測,因受條件限制,尚未對得到的結果和結論進行實驗驗證,但該仍可為CBP 蛋白的功能研究與ORFV的致病機制研究提供一定的參考。

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