刺參養(yǎng)殖池塘中一株植物乳桿菌的分離及其生物學(xué)特性*

張永剛 李 彬 王印庚 王金燕 廖梅杰 張 正 寧魯光 范瑞用

刺參養(yǎng)殖池塘中一株植物乳桿菌的分離及其生物學(xué)特性*

張永剛1,2,3李 彬2,3①王印庚2,3王金燕2,3廖梅杰2,3張 正2,3寧魯光4范瑞用5

(1. 大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 大連 116023；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 青島 266071；4. 山東海躍水產(chǎn)科技有限公司 東營(yíng) 257500；5. 青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司 青島 266400)

2017年5月，從山東東營(yíng)刺參()養(yǎng)殖池塘底泥中分離獲得49株乳酸菌。以刺參“腐皮綜合征”的2株致病菌[燦爛弧菌()和假交替單胞菌()]為指示菌進(jìn)行拮抗作用實(shí)驗(yàn)，獲得1株具有顯著抑菌活性的乳酸菌CLY-5，對(duì)該菌株進(jìn)行了生理生化實(shí)驗(yàn)、16S rDNA序列分析、生長(zhǎng)特性及其對(duì)刺參的安全性研究。結(jié)果顯示，菌株CLY-5對(duì)燦爛弧菌和假交替單胞菌具有較好的抑制作用，且菌株的胞內(nèi)產(chǎn)物與胞外產(chǎn)物均具有抑菌效果，抑菌圈分別為20 、23 mm和27 、38 mm，胞外產(chǎn)物的拮抗作用優(yōu)于胞內(nèi)產(chǎn)物。利用該菌對(duì)刺參進(jìn)行高濃度浸浴測(cè)試其安全性，濃度為1×109、1×108和1×107CFU/ml，實(shí)驗(yàn)期間刺參狀態(tài)良好，無(wú)死亡現(xiàn)象。16S rDNA序列分析表明，CLY-5與植物乳桿菌(NR117813.1)的相似性為100%，初步鑒定該菌株為植物乳桿菌。菌株CLY-5在30℃~44℃、pH 6~8范圍內(nèi)生長(zhǎng)較快，20 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，28~32 h達(dá)到生長(zhǎng)高峰。篩選的植物乳桿菌具有良好的抑菌能力，且其生長(zhǎng)特性適應(yīng)刺參池塘的養(yǎng)殖環(huán)境，為刺參疾病的生態(tài)防控及乳酸菌資源的開(kāi)發(fā)提供應(yīng)用數(shù)據(jù)參考。

刺參；腐皮綜合征；燦爛弧菌；假交替單孢菌；植物乳桿菌；抑菌活性

仿刺參()又稱(chēng)刺參，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值極高的海珍品，被譽(yù)為“海產(chǎn)八珍”之首，主要分布于遼寧、河北、山東沿海。2016年刺參養(yǎng)殖面積達(dá)到21.8萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量達(dá)到20.4萬(wàn)t (農(nóng)業(yè)部漁業(yè)漁政管理局, 2017)。然而，隨著刺參養(yǎng)殖業(yè)的迅速擴(kuò)展，特別是集約化與規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)的推廣，病害問(wèn)題也接踵而至，嚴(yán)重影響了該產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。刺參的主要疾病為“腐皮綜合征”，其發(fā)病率和死亡率高，是制約該養(yǎng)殖業(yè)的一大難題。已報(bào)道的主要致病菌有假交替單胞菌()(王印庚等, 2006)、燦爛弧菌()(張春云等, 2006)等。目前，水產(chǎn)動(dòng)物疾病大多采用抗生素類(lèi)化學(xué)藥物控制，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性和養(yǎng)殖環(huán)境微生物的生態(tài)平衡失調(diào)(Estefanía, 2013)。而乳酸菌既可抑制有害菌的生長(zhǎng)，又能改善水質(zhì)、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物生長(zhǎng)，逐漸成為水產(chǎn)健康養(yǎng)殖的研究熱點(diǎn)(Chi, 2014; Wang, 2015; Zhao, 2016)。

乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是一類(lèi)可以利用碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸且具有拮抗、免疫及營(yíng)養(yǎng)等作用的細(xì)菌的總稱(chēng)，作為一種天然活性益生菌廣泛分布于自然界中，在水產(chǎn)、畜禽及食品加工等產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用廣泛(譙仕彥等, 2014; 王睿迪等, 2018; Navinchandran, 2014; Khouadja, 2017; Li, 2018)。而乳酸菌在刺參養(yǎng)殖的應(yīng)用研究中，已初步揭示了乳酸菌對(duì)刺參生長(zhǎng)、免疫及養(yǎng)殖環(huán)境的作用。宮魁等(2013)發(fā)現(xiàn)，在刺參基礎(chǔ)飼料中添加乳酸菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)刺參腸道菌群平衡、免疫力及生長(zhǎng)均具有良好的促進(jìn)作用。張濤等(2009)利用乳酸菌和芽孢桿菌以不同濃度配比添加到飼料中進(jìn)行刺參飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)提高刺參的免疫功能有積極作用。然而，關(guān)于乳酸菌對(duì)刺參病害防控的研究鮮有報(bào)道，本研究從刺參養(yǎng)殖池塘底泥中篩選可抑制刺參主要病原菌的乳酸菌，并研究其生長(zhǎng)特性，為刺參池塘健康養(yǎng)殖提供優(yōu)良的乳酸菌株和應(yīng)用數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 池塘條件 本研究在山東省東營(yíng)市某刺參養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，池塘面積約為5.01 hm2，水深為1.5~2 m。水源來(lái)自近海海水，刺參密度為20萬(wàn)頭/hm2，規(guī)格約為1~2 g/頭，春秋季投喂鼠尾藻、海帶等餌料。

1.1.2 樣品采集 釆樣時(shí)間為2017年5月，水溫為23℃，鹽度為29；利用調(diào)查船駛到池塘中預(yù)先標(biāo)記好的采樣點(diǎn)，使用采泥器在池塘中間的2個(gè)點(diǎn)位分別采集池底底泥的表層物(約5 cm)，將其混合，4℃保存。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的培養(yǎng)與分離 稱(chēng)取底泥樣品1 g，使用滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)浞只靹?，收集上清液。用滅菌生理鹽水再對(duì)上清液進(jìn)行稀釋后，涂布MRS平板，37℃倒置培養(yǎng)24~48 h，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)、分離和保種，?80℃保存。

1.2.2 拮抗菌的篩選 以刺參“腐皮綜合征” 2種致病菌燦爛弧菌及假交替單胞菌為指示菌，采用牛津杯法測(cè)定分離的乳酸菌對(duì)2株致病菌的抑制效果。用接種環(huán)刮取少量指示菌，使用滅菌生理鹽水稀釋后，均勻涂布于牛津杯打孔的LB平板上。同樣，用接種環(huán)刮取活化24 h的分離菌株，使用滅菌生理鹽水稀釋到1×108CFU/ml，取150 μl置于小孔內(nèi)，37℃培養(yǎng)24~36 h，觀察小孔周?chē)志η闆r。最后，選取對(duì) 2株具有最佳抑菌效果的乳酸菌CLY-5作為候選益生菌，并進(jìn)一步開(kāi)展菌株CLY-5胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物抑菌效果比較及對(duì)刺參的安全性評(píng)價(jià)。

1.2.3 菌株胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物的抑菌效果比較

1.2.3.1 胞內(nèi)及胞外產(chǎn)物的制備 采用MRS液體培養(yǎng)基對(duì)乳酸菌CLY-5進(jìn)行培養(yǎng)，37℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液5000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，得到無(wú)細(xì)胞上清液，即為供試菌胞外產(chǎn)物，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩＞闏LY-5菌泥使用PBS沖洗3次后，用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，得到供試菌胞內(nèi)產(chǎn)物，隨即用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 胞內(nèi)及胞外產(chǎn)物抑菌效果比較 以燦爛弧菌及假交替單胞菌為指示菌，采用牛津杯法分別測(cè)定所制備的乳酸菌CLY-5胞內(nèi)產(chǎn)物和胞外產(chǎn)物對(duì) 2株致病菌的抑制效果。

1.2.4 菌株對(duì)刺參的安全性評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)用健康刺參來(lái)自山東省青島瑞滋海珍品發(fā)展有限公司，規(guī)格為15~20 g/頭。刺參在暫養(yǎng)7 d后隨機(jī)分組，每組20頭。實(shí)驗(yàn)水槽有效容積為25 L。分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其中，實(shí)驗(yàn)組采用浸浴方式，浸浴濃度為1×107、1×108和1×109CFU/ml，每個(gè)組別設(shè)3個(gè)平行。

實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行30 d，實(shí)驗(yàn)期間的水溫為16℃~18℃、鹽度為29，保持連續(xù)充氣，每天餌料按刺參重量的1%投喂，用虹吸法吸取水槽內(nèi)殘餌及糞便，日換水量為總水量的1/5，換水后，在水槽中加入相應(yīng)濃度菌液。每天觀察并記錄刺參的活力、體色、攝食、排便、病征及死亡等情況。

1.2.5 菌株的生理生化鑒定 參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ苽?.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木鷳乙海约?xì)菌微量檢定管進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測(cè)定。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》(東秀珠等, 2001)和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》(凌代文等, 1999)進(jìn)行歸類(lèi)判定。

1.2.6 菌株的16S rDNA序列分析 采用北京天根生物細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)菌DNA的提取。利用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物27F(5′-AGAGT- TTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTAC- CTTGTTACGACTT-3′)對(duì)細(xì)菌總DNA的相應(yīng)序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast檢索程序與NCBI基因庫(kù)中相關(guān)序列進(jìn)行比對(duì)，并通過(guò)MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.7 菌株生長(zhǎng)特性研究

1.2.7.1 不同溫度條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 參照孔彥卓等(2017)，將篩選菌株CLY-5接種于已滅菌的300 ml MRS液體培養(yǎng)基中，置于16℃、23℃、30℃、37℃、44℃、51℃、58℃細(xì)菌振蕩培養(yǎng)箱中，180 r/min恒溫培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，確定菌株的最適溫度。

1.2.7.2 不同pH條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 參考杜靜芳等(2017)，用1 mol/L的NaOH和HCl將MRS液體培養(yǎng)基pH分別調(diào)至2、4、6、8、10和12，將篩選菌株CLY-5接種于不同pH的300 ml MRS液體培養(yǎng)基中，180 r/min恒溫培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)，確定菌株最適pH。

1.2.7.3 繪制菌株生長(zhǎng)曲線 將乳酸菌CLY-5接種于已滅菌的300 ml MRS液體培養(yǎng)基中，根據(jù)菌株最適生長(zhǎng)溫度，180 r/min恒溫培養(yǎng)52 h。培養(yǎng)過(guò)程中每間隔4 h取1次樣品，計(jì)數(shù)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌的篩選

利用MRS培養(yǎng)基對(duì)刺參養(yǎng)殖池塘底泥樣品中的乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)、分離與純化，共獲得49株乳酸菌，分別編號(hào)為CLY-1~CLY-49。通過(guò)對(duì)指示菌的拮抗實(shí)驗(yàn)，篩選出1株具有顯著拮抗作用的乳酸菌CLY-5，該菌株對(duì)燦爛弧菌和假交替單胞菌均有良好的抑制作用(圖1)。該菌株形成的群落表面光滑、有光澤、中央隆起、不透明、乳白色或淡黃色、具有酸味。顯微鏡下呈直或彎桿狀，兩端呈圓形突起，革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)鞭毛、無(wú)芽孢(圖2、圖3)。

圖1 菌株CLY-5對(duì)病原菌的抑制作用

A：燦爛弧菌；B：假交替單孢菌

A:; B:

圖2 菌株CLY-5的革蘭氏染色

圖3 菌株CLY-5的透射電鏡

2.2 菌株胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物的抑菌效果比較

由圖4可以看出，候選菌株CLY-5的胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物對(duì)指示菌燦爛弧菌和假交替單胞菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，胞內(nèi)產(chǎn)物對(duì)上述2種指示菌的抑菌圈分別為20和23 mm，胞外產(chǎn)物對(duì)2種指示菌的抑菌圈分別為27和38 mm。結(jié)果顯示，候選菌株的胞外產(chǎn)物對(duì)指示菌的拮抗作用明顯優(yōu)于胞內(nèi)產(chǎn)物。

2.3 安全性實(shí)驗(yàn)

通過(guò)細(xì)菌高濃度脅迫實(shí)驗(yàn)測(cè)試篩選的乳酸菌CLY-5對(duì)刺參的安全性(表1)，浸浴組1.0×107CFU/ml在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中刺參健康，活力良好，攝食正常，無(wú)排臟、發(fā)病和死亡現(xiàn)象；浸浴濃度在1.0×108和1.0× 109CFU/ml的條件下，高濃度脅迫1 d后，分別有1和3頭刺參出現(xiàn)排臟現(xiàn)象，但無(wú)死亡現(xiàn)象。

圖4 菌株CLY-5胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制作用

A、B為菌株CLY-5胞內(nèi)產(chǎn)物對(duì)燦爛弧菌、假交替單孢菌的抑制作用；C、D為菌株CLY-5胞外產(chǎn)物對(duì)燦爛弧菌、假交替單孢菌的抑制作用

A, B: Effects of antibacterial activity of intracellular products of CLY-5 onand; C, D: Effects of antibacterial activity of extracellular products of CLY-5 onand

2.4 生理生化鑒定

通過(guò)對(duì)菌株CLY-5進(jìn)行生理生化鑒定，由表2可知，菌株CLY-5能分解利用葡萄糖、山梨醇、蜜二糖、木糖、蔗糖和甘露醇；3% NaCl尿素酶、3% NaCl、ONPG、苦杏仁苷和丙二酸鹽呈陽(yáng)性，不液化明膠，不產(chǎn)生H2S氣體，主要生理生化特征見(jiàn)表2。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類(lèi)鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》中乳桿菌屬的特征，對(duì)菌株CLY-5進(jìn)行分類(lèi)地位的鑒定，初步鑒定篩選菌株屬于乳桿菌科(Lactobacillaceae)。

2.5 菌株16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

采用通用引物對(duì)菌株CLY-5的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。使用Blast軟件對(duì)所獲得測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列相似性比對(duì)分析，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示。結(jié)果顯示，本研究分離獲得的菌株CLY-5屬于乳桿菌科乳桿菌屬()，與植物乳桿菌(NR 117813.1)的相似性為100%。

表1 菌株CLY-5的安全性實(shí)驗(yàn)

Tab.1 Safety testing of strain CLY-5 onto sea cucumber A. japonicus

2.6 菌株的生長(zhǎng)特性

2.6.1 菌株最適生長(zhǎng)溫度 菌株CLY-5在不同溫度下的生長(zhǎng)情況如圖6所示。菌株在16℃~58℃范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，在16℃~23℃范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度較緩慢，菌落數(shù)沒(méi)有顯著差異，30℃~44℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)；37℃時(shí)生長(zhǎng)速度最快，菌落數(shù)明顯高于其他溫度組。

2.6.2 不同pH條件對(duì)菌株CLY-5生長(zhǎng)的影響 菌株CLY-5在不同pH條件下的生長(zhǎng)情況如圖7所示。pH在2~12范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，但菌株在pH為2和12時(shí)生長(zhǎng)緩慢，pH為6時(shí)生長(zhǎng)速度最快。

2.6.3 生長(zhǎng)曲線 菌株CLY-5的生長(zhǎng)曲線如圖8所示。結(jié)果顯示，CLY-5在0~16 h時(shí)生長(zhǎng)較緩慢，20 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24~32 h時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)高峰，28 h時(shí)菌落數(shù)最高，達(dá)到2.13×1010CFU/ml，32 h后生長(zhǎng)速度緩慢下降，逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期。

3 討論

本研究從山東省東營(yíng)刺參養(yǎng)殖池塘底泥樣品中分離獲得49株乳酸菌，通過(guò)對(duì)刺參“腐皮綜合征” 2株致病菌的拮抗實(shí)驗(yàn)，獲得1株具有顯著抑菌活性的菌株CLY-5，通過(guò)對(duì)其生理生化及16S rDNA序列分析，該菌株鑒定為植物乳桿菌。植物乳桿菌因具有良好的益生菌特性，其報(bào)道較多(Lee, 2010; Jiang, 2016; 李存玉等, 2017; 韓墨等, 2018)。但從刺參養(yǎng)殖池塘中分離且對(duì)“腐皮綜合征”致病菌具有抑制作用的植物乳桿菌尚未見(jiàn)報(bào)道。

表2 菌株CLY-5的生理生化特征

Tab.2 Physiological and biochemical characteristics of strain CLY-5

注：+表示陽(yáng)性，-表示陰性

Note:+means positive reaction,-means negative reaction

圖5 基于16S rDNA序列的菌株CLY-5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

乳酸菌廣泛分布于動(dòng)物腸道中，能夠抑制腸道內(nèi)致病菌的生長(zhǎng)繁殖，并與腸粘膜免疫系統(tǒng)間相互作用，維持腸道內(nèi)的微生態(tài)平衡，使用乳酸菌逐漸成為預(yù)防動(dòng)物疾病的一項(xiàng)重要措施(Balcázar, 2008)。目前，關(guān)于乳酸菌抑菌作用機(jī)理的研究較多。Cai等(1998)證實(shí)了乳酸菌的抑菌物質(zhì)為乳酸；Lash等(2005)研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌ATCC8014的胞外產(chǎn)物對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性和陰性細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用，且發(fā)現(xiàn)起到抑制作用的物質(zhì)是植物乳桿菌分泌的一種細(xì)菌素。本研究也發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CLY-5的胞內(nèi)、胞外產(chǎn)物對(duì)刺參腐皮綜合征2株致病菌(假交替單胞菌和燦爛弧菌)均具有顯著抑菌活性，且胞外產(chǎn)物抑菌活性優(yōu)于胞內(nèi)產(chǎn)物。下一步將針對(duì)具有抑制作用的胞外產(chǎn)物進(jìn)行成分分析和鑒定，闡明胞外產(chǎn)物的抑菌機(jī)理。

溫度、pH是影響乳酸菌生長(zhǎng)的重要因素，探究乳酸菌的生物學(xué)特性對(duì)掌握其最適培養(yǎng)條件具有重要意義，可為其發(fā)酵生產(chǎn)提供理論依據(jù)。本研究篩選的植物乳桿菌CLY-5最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH為6，20 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，28 h時(shí)生長(zhǎng)進(jìn)入高峰期，活菌數(shù)量可達(dá)2.13×1010CFU/ml。本研究結(jié)果與杜斌等(2018)對(duì)植物乳桿菌CJY1-1的生物學(xué)特性研究結(jié)論相似。曲磊等(2018)研究1株魚(yú)源植物乳桿菌C20015的生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，菌株在10 h開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，20 h時(shí)細(xì)菌數(shù)達(dá)到最大值3.6×109CFU/ml，50℃時(shí)，C20015活菌數(shù)下降不明顯，其生物學(xué)特性與本研究結(jié)果有一定差異。菌株CLY-5與C20015相比，前者進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期雖然時(shí)間較晚，但在生長(zhǎng)高峰時(shí)菌量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者。從生物學(xué)特性來(lái)看，植物乳桿菌CLY-5的發(fā)酵可在溫度、酸堿度較大閾值范圍內(nèi)進(jìn)行，進(jìn)入高峰期快，且高峰期活菌數(shù)量大，適宜進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。

圖6 不同溫度下菌株CLY-5的生長(zhǎng)情況

圖7 不同pH對(duì)菌株CLY-5生長(zhǎng)的影響

圖8 菌株CLY-5的生長(zhǎng)曲線

益生菌的安全性和合理性使用引起研究學(xué)者的高度重視，一些益生菌的過(guò)量使用會(huì)引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物出現(xiàn)病癥，枯草芽孢桿菌()可引起斑節(jié)對(duì)蝦()細(xì)菌性白斑綜合征(Wang, 2000)；蠟樣芽孢桿菌()可引起刺參“腐皮綜合征”及凡納濱對(duì)蝦()白斑病(駱?biāo)囄牡? 2009; Velmurugan, 2015)。目前，尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于乳酸菌造成水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的報(bào)道。本研究篩選的植物乳桿菌CLY-5以1.0×107CFU/ml浸浴健康刺參，供試刺參在30 d時(shí)均無(wú)發(fā)病體征和死亡現(xiàn)象，刺參健康、攝食正常、活力良好。雖然，乳酸菌浸浴濃度為1.0×108和1.0×109CFU/ml實(shí)驗(yàn)組少量刺參個(gè)體出現(xiàn)了不同程度的排臟現(xiàn)象，這可能是刺參在高濃度乳酸菌脅迫下出現(xiàn)的應(yīng)激反應(yīng)。關(guān)于植物乳桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的應(yīng)用方面，Talpur等(2013)在遠(yuǎn)海梭子蟹()幼蟹養(yǎng)殖水體中添加濃度為5.0×106CFU/ml的植物乳桿菌，可以顯著提高幼蟹的成活率及蛋白酶和淀粉酶活性，同時(shí)可以改善養(yǎng)殖水質(zhì)。劉長(zhǎng)軍(2018)在羅非魚(yú)飼料中添加濃度為1.0×107CFU/ml的植物乳桿菌，可顯著提高羅非魚(yú)的增重率和特定生長(zhǎng)率。Suzer等(2008)在黑鯛()仔魚(yú)水體中加入含植物乳桿菌的復(fù)合乳酸菌，可提高仔魚(yú)的生長(zhǎng)性能及消化酶活性。對(duì)植物乳桿菌CLY-5進(jìn)行了刺參大水面池塘養(yǎng)殖應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，其對(duì)刺參池塘水質(zhì)具有良好調(diào)控作用，同時(shí)對(duì)刺參生長(zhǎng)也有良好的促進(jìn)作用(另文報(bào)道)。初步的養(yǎng)殖實(shí)踐顯示，將植物乳桿菌CLY-5發(fā)酵生產(chǎn)后潑灑到刺參養(yǎng)殖池水中，對(duì)刺參是安全的。然而，我國(guó)刺參養(yǎng)殖以池塘養(yǎng)殖為主，這種開(kāi)放式養(yǎng)殖模式的廢水大多數(shù)是直接排放入海，大量使用植物乳桿菌作為水產(chǎn)微生態(tài)制劑是否對(duì)其他海水養(yǎng)殖種類(lèi)、淺海生態(tài)環(huán)境及菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，還需進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，植物乳桿菌CLY-5具有對(duì)外界適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)溫度范圍廣、抑菌能力強(qiáng)，且該菌株對(duì)刺參是安全的。今后將進(jìn)一步對(duì)植物乳桿菌CLY-5進(jìn)行深入研究，探索其對(duì)刺參生長(zhǎng)、生殖、免疫和養(yǎng)殖池塘菌群結(jié)構(gòu)的影響，開(kāi)展水域生態(tài)環(huán)境的安全性評(píng)價(jià)，為水產(chǎn)動(dòng)物乳酸菌類(lèi)微生態(tài)制劑的規(guī)模化及商品化推廣奠定基礎(chǔ)。

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Screening and Characteristic Analysis offrom Ponds for Sea Cucumber Farming

ZHANG Yonggang1,2,3, LI Bin2,3①, WANG Yingeng2,3, WANG Jinyan2,3, LIAO Meijie2,3, ZHANG Zheng2,3, NING Luguang4, FAN Ruiyong5

(1. College of Fisheries and Life Science, Dalian Ocean University, Dalian 116023; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071; 3. Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao 266071; 4. Shandong Haiyue Aquatic Science and Technology Co. Ltd, Dongying 257500; 5. Qingdao Ruizi Seafood Development Co. Ltd, Qingdao 266400)

Forty-nine lactic acid bacteria strains were isolated from sediment samples from cultured ponds of sea cucumbers () in Dongying, Shandong Province, in May 2017. First, antagonistic bacterial experiments were conducted usingand, which are the main pathogenic bacteria of “skin ulcer syndrome” for sea cucumbers, and a lactic acid bacteria CLY-5, which has demonstrated significant bacteriostatic activity. Next, physiological and biochemical experiments and a similarity analysis of 16S rDNA sequences as well as the growth character of CLY-5 were carried out. A safety experiment for sea cucumbers was also performed. The results revealed that CLY-5 strain successfully inhibitedand. Meanwhile, the strain’s intracellular and extracellular products effectively inhibitedandas demonstrated by inhibition zone diameters of 20 mm, 23 mm, and 27 mm, 38 mm, respectively,with extracellular products showing superior performance compared with intracellular products. Dipping bath concentrations were set to 1×109, 1×108, and 1×107CFU/ml to test the safety of CLY-5 for sea cucumbers. During the experiment, all sea cucumbers were in good conditions. Based on the 16S rDNA sequence analysis, strain CLY-5 was determined to be identical toNR117813.1. In addition, strain CLY-5 exhibited superior growth at 30℃~44℃ and salinities of 6 to 8. Moreover, CLY-5 came into a logarithmic growth phase after 20 h of cultivation and reached peak growth after 28~32 h. In summary, strain CLY-5 could be used to reduce the occurrence of sea cucumber disease and is also suitable for pond culture environment. These results provide a basis for ecological prevention strategies in disease control, and should prove useful in the development and utilization of lactic acid bacteria.

;Skin ulcer syndrome;;;;Antagonistic activity

S9174；S968.9

A

2095-9869(2019)06-0154-09

10.19663/j.issn2095-9869.20180912002

http://www.yykxjz.cn/

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* 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(20603022016008)、中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金(2018GH10)、山東省農(nóng)業(yè)良種工程重大課題(2017LZGC010)、威海市海洋經(jīng)濟(jì)創(chuàng)新發(fā)展示范城市產(chǎn)業(yè)鏈協(xié)同創(chuàng)新類(lèi)項(xiàng)目和山東省自主創(chuàng)新成果轉(zhuǎn)化專(zhuān)項(xiàng)(2013ZHZX2A0801)共同資助[This work was supported by the Special Scientific Research Funds for Central Non-Profit Institutes, Yellow Sea Fisheries Research Institute, CAFS(20603022016008), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS(2018GH10), Agriculture Seed Improvement Project of Shandong Province(2017LZGC010), Industrial Chain Collaborative Innovation Project for Marine Economic Innovation and Development Demonstration in Weihai, and Independent Innovation and Achievements Transformation of Shandong Province (2013ZHZX2A0801)]. 張永剛，E-mail: 2418342572@qq.com

李 彬，E-mail: libin@ysfri.ac.cn

2018-09-12,

2018-10-08

LI Bin, E-mail: libin@ysfri.ac.cn

(編輯 馬璀艷)