PCR快速檢測淋病奈瑟菌NspA基因方法的建立及分析

王 彥，王 琨，劉小林，劉 霞，王西珍*

（連云港市第二人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 連云港 222000）

淋病病原體是淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae，NG）俗稱淋球菌，它的唯一天然宿主是人類。淋病奈瑟菌NspA基因是淋球菌表面蛋白A的表達基因，有研究發(fā)現(xiàn)NspA抗原不但在細菌表面持續(xù)表達，而且高度保守，淋球菌NspA氨基酸序列在淋球菌菌株之間的同源性高達98%。本研究旨在尋找一種快速檢測淋球菌的方法，為臨床診治贏得寶貴時間。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收集自2016年9月～2018年3月我院皮膚性病科、男性科、泌尿外科門診疑似淋病患者，其中男性取尿道分泌物，女性取距宮頸口1～1.5 cm處分泌物，裝入無菌試管，-80℃冷凍備用。從中選取10例經(jīng)VITEK-2 COMPACT全自動微生物分析儀鑒定為淋病奈瑟菌的患者分泌物用PCR方法擴增NspA基因。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計和合成引物

以淋球菌DNA為模板，根據(jù)GeneBank報道的NspA(gi:26324161) 核甘酸序列，利用Primer Premier 5.0軟件自行設(shè)計引物和探針，由invitrogen公司合成。引物如下：

上游引物 P1: 5′-GCATGAAAAAAGCACTTGCC-3′

下游引物P2: 5′-CCGTCAGAATTTGACGCGCAC-3′

用PCR來驗證所設(shè)計引物的特異性，并使用淋球菌標準菌株CMCC 29403作為陽性對照；用可能成為尿道感染致病菌的標準菌株大腸埃希菌ATCC25922，作為陰性對照（由江蘇省臨檢中心提供）。

1.2.2 DNA的提取和擴增

1.2.2.1 臨床樣本的DNA提取

把10例臨床樣本的棉拭子在磷酸鹽緩沖液（PBS）中（2 mL）擠壓洗1～2 min，并用Votex漩渦振蕩器振蕩1min，棄去棉拭子使分泌物盡量溶于生理鹽水中，懸浮液放入離心機3000 r/min離心5 min（離心半徑16 cm），棄上清液，用1mL無菌生理鹽水懸浮細胞，放入離心機，3000 r/min離心5 min（離心半徑16 cm），棄上清液，細胞重新溶于1×TE緩沖液中（100 μL），100℃加熱煮沸10 min后放入離心機12000 r/min離心10 min(離心半徑16 cm)，上清液含DNA模板，用于PCR擴增。

1.2.2.2 陽性對照、陰性對照

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》要求，取淋球菌標準菌株CMCC 29403增菌后接種于巧克力培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用苯酚-氯仿法提取淋球菌基因組DNA，PCR擴增NspA基因，作為陽性對照。以同樣方法取標準菌株大腸埃希菌ATCC25922作為陰性對照。

1.2.2.3 NspA基因的PCR擴增

取已準備好的10例臨床樣本DNA，用設(shè)計的P1和P2為引物，PCR擴增NspA基因，25 μL反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer 2.5 μL；10 μmol/L上游引物1 μl；10 μmol/L下游引物1 μL；dNTP 1.5 μL；Taq 酶0.5 μL；模板DNA 1μL；去離子水17.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min；94℃ 60 S；58℃ 45 S；72℃ 1 min；共35個循環(huán)；最后72℃ 10 min。

1.2.2.4 NspA基因核苷酸序列鑒定

按PCR膠回收純化試劑盒說明書純化PCR產(chǎn)物，將經(jīng)柱式膠回收純化臨床PCR產(chǎn)物送往INVITROGEN公司進行測序鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增NspA基因

采用P1和P2為引物，對已準備好的10例臨床樣本DNA模板進行PCR擴增，在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳，得到一條與NspA預(yù)期相符大小約為528 bp的清晰條帶，與本實驗設(shè)計相符，見圖1。

圖1 NspAPCR擴增產(chǎn)物1.0%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 序列測定

本研究PCR擴增的10例臨床NspA基因全長528 bp（含起始密碼和終止密碼），編碼175個氨基酸。對測序結(jié)果作Blastn分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR擴增的臨床NspA基因序列與GeneBank報道的淋球菌（CMCC 29403）NspA（gi:215260656）核苷酸序列完全一致，見圖2。

圖2 NspA基因核苷酸序列

3 討 論

淋球菌能夠引起泌尿生殖系統(tǒng)的化膿性感染，臨床表現(xiàn)為有典型的尿痛及尿道膿性分泌物，人類是它唯一的天然宿主。淋病好發(fā)于尿道引起淋病性尿道炎，如治療不及時，還可侵入泌尿生殖器的其他部位，引起前列腺炎、附睪炎、盆腔炎、輸卵管炎等，也可侵犯眼睛、咽部、直腸，甚至經(jīng)血液播散到全身形成淋球菌性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、腱鞘炎等合并癥。

目前一種用來放大擴增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)是聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR），其一次性地將反應(yīng)液加好后進行變性-退火-延伸反應(yīng)。擴增反應(yīng)一般在2～4小時內(nèi)完成，擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，無放射性污染、易推廣。

細菌培養(yǎng)法是世界衛(wèi)生組織推薦診斷淋球菌的“金標準”，然而報告時間較長、操作繁瑣。不少患者在就診前都接受過非正規(guī)的抗生素治療，再加上淋球菌生長條件苛刻，對外界抵抗力較低，增加細菌培養(yǎng)難度，影響檢出率。而PCR檢測法由于有較高的特異性和敏感性，因而廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，不管患者分泌物中的活菌或死菌都可檢出[1]。一般細菌培養(yǎng)及VITEK．MS質(zhì)譜鑒定，需要較長時間才能最后確定到菌種[2]，應(yīng)用VITEK．MS質(zhì)譜技術(shù)來進行細菌鑒定，雖然有較完整的微生物圖譜庫進行結(jié)果比對[3]，但儀器設(shè)備價格昂貴，中小型醫(yī)院難以普及。淋球菌常規(guī)培養(yǎng)檢測和鑒定也是需2～3天的時間，常常延誤診斷和治療。而PCR檢測淋球菌保守的NspA基因只需2～3小時便能獲得數(shù)據(jù)，具有較高的特異性及敏感性，縮短了檢測時間，快速做出診斷，早發(fā)現(xiàn)、早治療，給臨床診治贏得寶貴時間。