應(yīng)用數(shù)學(xué)優(yōu)選法對(duì)組織切片中細(xì)胞核DNA定量分析

朱 榮 唐 峰 胡錫琪 徐元鼎

(1復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032; 2復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科 上海 200040)

病理是腫瘤診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤的病理診斷依靠對(duì)組織的取材、制片,病理醫(yī)師顯微鏡觀察,根據(jù)形態(tài)學(xué)變化來診斷。這種傳統(tǒng)的定性方法不但效率低,而且主觀性大,特別是對(duì)某些腫瘤的分級(jí)和良惡性界定,不同組織機(jī)構(gòu)或個(gè)人,診斷結(jié)果大相徑庭,給臨床治療帶來困擾,所以需要尋找一種更為高效、客觀、自動(dòng)化的診斷手段。20世紀(jì)80年代基于細(xì)胞核DNA的Feulgen染色和計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)的一種新的病理診斷方法,即圖像分析細(xì)胞儀問世,簡稱ICM。美國CAS公司生產(chǎn)的CAS細(xì)胞分析系統(tǒng)問世以來獲得了廣泛應(yīng)用[1]。直到20世紀(jì)90年代末,人們發(fā)現(xiàn)這種技術(shù)雖然在細(xì)胞涂片的診斷上獲得了巨大成功,但在組織切片上的應(yīng)用存在致命缺陷:細(xì)胞學(xué)樣品中的絕大多數(shù)細(xì)胞核是完整的,一個(gè)完整的正常二倍體細(xì)胞其DNA含量是7.18pg,而組織切片中的細(xì)胞核不完整,僅是一個(gè)片段或一個(gè)平面。不僅如此,不同切片其面積也有大小,所以無法核定其完整細(xì)胞核的DNA含量[2]。由于細(xì)胞核DNA 含量的測定與倍體分析都應(yīng)以單個(gè)完整細(xì)胞核個(gè)體(或體積)內(nèi)的DNA含量為測量和分析基礎(chǔ),因此不少學(xué)者對(duì)ICM技術(shù)在組織切片中的應(yīng)用提出異議。采用ICM技術(shù)對(duì)細(xì)胞涂片進(jìn)行輔助病理診斷一直延用至今,國內(nèi)廈門麥克迪奧公司生產(chǎn)的細(xì)胞DNA定量分析系統(tǒng)針對(duì)婦產(chǎn)科病理的臨床細(xì)胞學(xué)診斷,在界定腫瘤良惡性方面得到廣泛的應(yīng)用。而此項(xiàng)技術(shù)在病理組織切片上的應(yīng)用已遭淘汰,尚無改進(jìn)方法。我們找到一種在組織切片上通過大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理技術(shù),即數(shù)學(xué)中的優(yōu)選原則結(jié)合一定的篩選法則,對(duì)切片中的細(xì)胞先做處理篩選再分析,獲得理論上的成功,并對(duì)此進(jìn)行了臨床驗(yàn)證,獲得了滿意的效果。

資料和方法

研究對(duì)象49例惡性腫瘤和非腫瘤性良性病變病例來自2018年復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院病理科存檔,臨床和病理診斷明確,資料完整。其中惡性腫瘤42例,非腫瘤性良性病變7例。42例惡性腫瘤中,胃腸腺癌19例、肝膽管細(xì)胞癌2例、肝細(xì)胞癌10例、肝轉(zhuǎn)移性腺癌1例、肺腺癌3例、肺腺鱗癌1例、肺鱗狀細(xì)胞癌1例、食管鱗狀細(xì)胞癌1例、乳腺浸潤性導(dǎo)管癌2例、甲狀腺微灶癌1例、腦惡性膠質(zhì)瘤1例;7例非腫瘤性良性病變分別為肝硬化2例,乳腺病、結(jié)腸炎、成骨細(xì)胞增生、肝炎伴肝壞死、胃癌陰性淋巴結(jié)各1例。

組織切片的制備、染色和DNA定量分析標(biāo)本經(jīng)4%甲醛水溶液固定,組織取材后常規(guī)脫水、石蠟包埋,制成2張5 μm厚連續(xù)切片,其中1張HE染色后由兩位資深醫(yī)師進(jìn)行光鏡觀察并作出病理診斷;另一張按國際細(xì)胞學(xué)會(huì)制定的操作流程進(jìn)行Feulgen染色,用于DNA定量分析。

DNA定量檢測采用moticytometer系統(tǒng)(廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷系統(tǒng)有限公司),通過自動(dòng)數(shù)碼顯微鏡以及攝像頭對(duì)整張標(biāo)本切片進(jìn)行高速掃描,獲得切片中全部細(xì)胞,自動(dòng)測量每個(gè)細(xì)胞的DNA含量(光密度*面積),常規(guī)選擇正常淋巴結(jié)內(nèi)的淋巴細(xì)胞作為對(duì)照,比值即為DNA 指數(shù)(DNA index,DI)。作為對(duì)照的正常淋巴細(xì)胞,其DI值設(shè)定為1。將整張切片中所有細(xì)胞的測量值導(dǎo)入自行設(shè)計(jì)的數(shù)學(xué)分析軟件,經(jīng)分析處理,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選后得出最終DNA含量值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析DI值的判定標(biāo)準(zhǔn):DI值≤1為良性病變;>1為異常,即異倍體細(xì)胞,判定為惡性[1]。使用SPSS 21.0軟件,以組織病理學(xué)診斷結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn),χ2四格表計(jì)算DNA 定量分析系統(tǒng)診斷的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和Youden指數(shù)等。

結(jié) 果

以數(shù)學(xué)優(yōu)選為原則的統(tǒng)計(jì)處理方法將每例病理切片中所有細(xì)胞的DNA含量值按數(shù)學(xué)中位數(shù)排序,淘汰小于中位數(shù)值的細(xì)胞。例如:病理號(hào)為1802746,病理診斷為結(jié)腸腺癌的切片中,共計(jì)有22 000個(gè)細(xì)胞,將其中大于中位數(shù)的細(xì)胞求得DNA含量均值為4.01。正常淋巴結(jié)切片18268301按同法處理,求得DNA含量均值為1.52。癌組織與正常組織的比值為2.64,此即DI值。由于DI>1.0,可診斷為惡性。此數(shù)值越高,惡性程度越高。所有病例均按此方法統(tǒng)計(jì)處理。

表1 組織病理學(xué)診斷和DNA定量分析基本情況Tab 1 The general information of histopathology and DNA quantification

OD:Optical density.

DNA定量分析系統(tǒng)的診斷效力組織病理學(xué)診斷和DNA 定量分析診斷的比較見表2。DNA 定量分析系統(tǒng)診斷靈敏度為97.62%,特異度為100.00%,陽性預(yù)測值100.00%,陰性預(yù)測值87.50%,正確指數(shù)(Youden指數(shù))為0.98,誤診率為0,漏診率為2.38%,假陽性率為0,假陰性率為2.38%,準(zhǔn)確度為97.96%。

表2 組織病理學(xué)診斷和DNA 定量分析診斷的比較Tab 2 The comparison of histopathological diagnosis and DNA quantification

討 論

細(xì)胞核DNA定量越來越多地被應(yīng)用于良惡性腫瘤的界定和惡性腫瘤的病理診斷及分級(jí)。應(yīng)用組織切片的Feulgen染色和圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞DNA含量測定和統(tǒng)計(jì)分析,能顯示2倍體或多倍體及非整倍體DNA的百分含量,可反映染色體的畸變及程度[3]。其臨床應(yīng)用價(jià)值主要有以下方面:(1)早期檢測出癌及癌前病變。癌癥是一種染色體疾病,致癌物質(zhì)和偶發(fā)的有絲分裂錯(cuò)誤都是通過產(chǎn)生非整倍體引發(fā)腫瘤。80%～90%的實(shí)體腫瘤內(nèi)存在非整倍體細(xì)胞,這種細(xì)胞的出現(xiàn)是提示早期惡性病變的重要標(biāo)志。癌癥早期,在病理醫(yī)師的顯微鏡觀察還不能感知病變的情況下,可以通過非整倍體來區(qū)分惡性腫瘤和“相貌雷同”的良性腫瘤或正常組織,實(shí)現(xiàn)癌及癌前病變的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療,對(duì)患者的預(yù)后至關(guān)重要。(2)腫瘤惡性程度及預(yù)后評(píng)估和指導(dǎo)腫瘤治療。整倍體腫瘤預(yù)后通常較非整倍體更好,同時(shí)非整體細(xì)胞是否消失直接反映放、化療的效果好壞。癌癥晚期,檢查與耐藥或轉(zhuǎn)移性相關(guān)的非整倍體,有助于臨床醫(yī)師選擇最適合患者的個(gè)性化治療方案,也是目前提倡的精準(zhǔn)醫(yī)療中不可或缺的重要手段之一。(3)減少病理診斷中的主觀因素,提高病理學(xué)檢測工作效率,減輕病理醫(yī)師的勞動(dòng)強(qiáng)度。傳統(tǒng)的病理學(xué)人工診斷,在顯微鏡下逐一視野觀察,費(fèi)時(shí)費(fèi)力,且主觀性強(qiáng),敏感度較低,易受人為因素影響。通過細(xì)胞DNA定量分析系統(tǒng),病理醫(yī)師僅需對(duì)少數(shù)可疑或陽性病例進(jìn)行復(fù)核,大大減輕勞動(dòng)強(qiáng)度。此技術(shù)敏感性高(>95%),能有效降低漏診率;具有完備的質(zhì)控體系,能消除人工診斷中的主觀性,使結(jié)果更加客觀,可重復(fù)性高。

圖像分析技術(shù)將腫瘤細(xì)胞DNA含量,倍體分析與病理組織形態(tài)學(xué)相結(jié)合,在病理診斷中顯示出很好的價(jià)值。但也存在一些缺點(diǎn),其中最主要的是某些人為因素或計(jì)算機(jī)程序的選擇處理不當(dāng),會(huì)直接影響測定結(jié)果[4]。近年來隨著病理學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,Feulgen染色的標(biāo)準(zhǔn)化和機(jī)械化、圖像分析系統(tǒng)硬件質(zhì)量的提高和軟件學(xué)習(xí)能力的增強(qiáng)等極大地方便了操作和減少了人為因素對(duì)結(jié)果的影響,選擇更加合適的計(jì)算方法和程序?qū)D像及數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,成為提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、增加腫瘤診斷的敏感性、降低非特異性的關(guān)鍵。細(xì)胞核DNA 含量的測定與倍體分析都應(yīng)以單個(gè)完整細(xì)胞核個(gè)體(或體積)內(nèi)的DNA含量為測量和分析基礎(chǔ)。細(xì)胞學(xué)樣品中的絕大多數(shù)細(xì)胞核是完整的,但組織切片內(nèi)的細(xì)胞核只是完整細(xì)胞核的一部分,以體積(面積*切片厚度)為單位的DNA 含量取決于細(xì)胞核截面積和平均DNA 含量。前者與完整細(xì)胞核個(gè)體的體積大小、形狀、空間取向和截面在細(xì)胞核內(nèi)的位置有關(guān);后者與切片厚度和單位細(xì)胞核體積的DNA 含量密度有關(guān)。即使相同厚度或同一組織切片,不同的細(xì)胞核個(gè)體在體積、形狀、大小、空間分布與空間取向也不完全相同,切片中的細(xì)胞核在完整細(xì)胞核內(nèi)的位置、體積占其完整體積的比率也不一樣,以此為基礎(chǔ)選擇參照和計(jì)算不同樣本中腫瘤細(xì)胞的DNA 倍體存在不客觀性[5]。實(shí)驗(yàn)表明,與細(xì)胞學(xué)涂片相比,組織切片測量結(jié)果精確性與準(zhǔn)確性較差,不能正確評(píng)估細(xì)胞核DNA含量倍體狀態(tài),分析測量結(jié)果時(shí)可能將正常四倍體或八倍體細(xì)胞核誤判為非整倍體,得出錯(cuò)誤結(jié)論[2]。因此,圖像分析組織切片內(nèi)細(xì)胞核DNA 的含量和倍體數(shù),必須采用與之相適應(yīng)的、更為科學(xué)的測量和分析方法。

對(duì)組織切片中細(xì)胞核DNA含量和倍體的分析,采用以往圖像數(shù)據(jù)處理的方法,存在的主要問題有:(1)相同倍體、形狀和體積,或相同倍體和形狀、不同體積或相同倍體和體積、不同形狀的完整細(xì)胞核在同一薄切片內(nèi)可形成不同大小的細(xì)胞核切片,測得不同的積分吸光度值,被誤認(rèn)為是不同倍體的細(xì)胞;(2)不同倍體、相同形狀和體積或不同倍體和形狀、相同體積或不同倍體和體積、相同形狀的完整細(xì)胞核,在同一薄切片內(nèi)不同大小的細(xì)胞核切片,可測得相同的積分吸光度,被誤認(rèn)為是相同倍體的細(xì)胞;(3)組織內(nèi)大多數(shù)二倍體參考細(xì)胞核的體積小于腫瘤細(xì)胞核的體積,在同一薄切片內(nèi)的切片體積占自身完整體積的百分率大于腫瘤細(xì)胞,以其測量均值為基礎(chǔ)計(jì)算的腫瘤細(xì)胞DNA 倍體值偏小,偏小的程度難以估計(jì)[3]。因此,我們建立了一種全新的對(duì)組織切片中細(xì)胞核DNA含量和倍體分析的方法,采用大數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析處理技術(shù),即數(shù)學(xué)中的優(yōu)選原則結(jié)合一定的篩選法則,對(duì)切片中的細(xì)胞先做處理再分析。從以上49例測定結(jié)果來看,對(duì)良惡性的判定與傳統(tǒng)病理診斷的符合率較高。只有1例不符合的病例為甲狀腺微灶癌,此腫瘤微小,直徑小于0.5 cm。組織學(xué)形態(tài)上細(xì)胞異型性小,預(yù)后極好,幾乎無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,治療以單純結(jié)節(jié)切除為主[6]?，F(xiàn)認(rèn)為臨床上甲狀腺微灶癌存在過度診斷現(xiàn)象,診斷標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步商榷。

本研究是對(duì)新的計(jì)算處理法則的初步應(yīng)用,今后將用更多的臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證。選取的病種數(shù)較多正是此方法的優(yōu)點(diǎn)之一。當(dāng)前的人工智能病理診斷主要集中在對(duì)圖像的學(xué)習(xí)和識(shí)認(rèn)方面,由于不同組織器官和腫瘤間的圖像差異巨大,再加上個(gè)體之間以及惡性腫瘤自身的異質(zhì)性,使得不同的腫瘤需要不同的圖像識(shí)別診斷體系,各病種間的診斷系統(tǒng)不能通用,這樣就大大降低了智能診斷系統(tǒng)的效率。而本研究基于對(duì)DNA含量分析的技術(shù)可以不變應(yīng)萬變,在良惡性腫瘤的判定上具有通用性和高效性的優(yōu)點(diǎn)。49例病例雖較少,且組織來源、大小和細(xì)胞數(shù)均存在差異,但仍初步說明能區(qū)別各病種的良性和惡性,有進(jìn)一步研究的價(jià)值。這種應(yīng)用DNA定量分析系統(tǒng)結(jié)合人工智能大數(shù)據(jù)以及數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析的方法在病理切片中的應(yīng)用是一種打破傳統(tǒng)的創(chuàng)新手段,病理切片診斷有望進(jìn)入一個(gè)非人工定量的新階段。如把此項(xiàng)技術(shù)轉(zhuǎn)化為系統(tǒng),即把現(xiàn)有的DNA定量分析系統(tǒng)與數(shù)學(xué)分析軟件一體化,則可形成一鍵搞定全自動(dòng)的組織學(xué)診斷系統(tǒng),有利于進(jìn)一步推廣。最后值得注意的是,雖然人工智能在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛,但能應(yīng)用到病理分析方面的難度系數(shù)相對(duì)較大。醫(yī)學(xué)水平?jīng)Q定人工智能水

平,人工智能終究代替不了醫(yī)師。人工智能應(yīng)該與人類病理專家形成互補(bǔ),以此提高人工診斷的效率和準(zhǔn)確性,這是最合理的應(yīng)用方式。