桑黃正丁醇提取物對(duì)白念珠菌生物膜形成的抑制作用

汪天明，邸 磊，施高翔，劉慧敏，汪長(zhǎng)中，李 寧

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230032；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，安徽 合肥 230012；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012)

白念珠菌(Candidaalbicans)是一種常見的條件致病真菌[1]，平時(shí)定植于人體的皮膚、口腔、胃腸道及陰道等部位，當(dāng)機(jī)體抵抗力降低或菌群失調(diào)時(shí)，白念珠菌會(huì)過(guò)度增殖，引起上述部位的感染[2]。有研究表明,醫(yī)院內(nèi)條件性真菌感染中78%～80%是由該菌引起[3]。

在體外，白念珠菌在一定條件下還可附著在植入的醫(yī)療設(shè)備上，形成能夠耐受高濃度抗真菌藥物的生物膜。生物膜主要由包埋于其中的菌體及β-葡聚糖和細(xì)胞外DNA等組成。生物膜狀態(tài)的菌體不僅耐藥，還能夠引起慢性感染。對(duì)于白念珠菌生物膜，目前尚無(wú)有效的西藥進(jìn)行干預(yù)[4]。

中藥桑黃(Phellinusigniarius)在臨床上具有活血、止血、化瘀、抑菌、止瀉之功效[5-7]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桑黃提取物對(duì)白念珠菌具有一定的抑制作用。故本實(shí)驗(yàn)擬探討桑黃正丁醇提取物(butyl alcohol extract ofphellinusigniariusdecoction，BAEP)對(duì)白念珠菌主要致病因素之一即生物膜的影響，旨在為其可能用于治療白念珠菌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與菌株 ①白念珠菌(Candidaalbicans)標(biāo)準(zhǔn)株SC5314：由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院姜遠(yuǎn)英教授惠贈(zèng)。②桑黃：由安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院李寧教授實(shí)驗(yàn)室提供。③BAEP制備：取桑黃子實(shí)體粉適量，加8倍70%甲醇回流提取3次，每次2 h，合并濾液，真空回收溶劑，得濃縮物，濃縮物水分散后，依次用10倍容積石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取5次，真空揮干溶劑，分別得到桑黃石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水4部分提取物。④陽(yáng)性對(duì)照藥物為氟康唑(fluconazole，F(xiàn)LZ)(批號(hào) J09M6B1):由上海源葉生物科技有限公司提供。

1.2 試劑及材料 XTT粉(批號(hào) F523BA0012)：加拿大BBI公司；熒光素二乙酸酯(fluorescein diacetate，F(xiàn)DA)(批號(hào) F16551)：上海翊圣科技有限公司；25%戊二醛(批號(hào) 0715A19)、PBS(批號(hào) 0428A16)：雷根生物技術(shù)有限公司；ALS1、HWP1引物：上海生工生物工程有限公司；Total RNA提取試劑(批號(hào) 742100)、PCR反應(yīng)試劑(批號(hào) 841200)：日本ToyoBo公司；DEPC處理水、Zemolyase酶(批號(hào) SLBP5261V)：金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇(批號(hào) 20190710JN)：天津市大茂化學(xué)試劑廠；瓊脂糖(批號(hào) 182195)：上海滬試分析儀器有限公司；TAE(批號(hào) 690674223)：上海聯(lián)邁生物工程有限公司；RPMI 1640(批號(hào) 2023235)：美國(guó)Life technologies；沙氏培養(yǎng)基(批號(hào) 20190425)：青島高科技海博生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板：上海求精生化試劑儀器有限公司；CKX41-32型倒置顯微鏡：日本Olympus公司；DMI60000B倒置熒光顯微鏡：德國(guó)徠卡光學(xué)儀器公司；Regulus 8100冷場(chǎng)發(fā)射式掃描電鏡：日本日立公司；K3型酶標(biāo)儀：賽默飛世爾科技公司；ABI 7500熒光定量PCR儀：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

2 方法

2.1 菌液配制 按文獻(xiàn)[8]方法配制菌液。從4 ℃保存的沙氏瓊脂平板上挑取白念珠菌單菌落，接種至液體沙氏培養(yǎng)液，37 ℃恒溫過(guò)夜培養(yǎng)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，RPMI 1640(pH 7.0)培養(yǎng)液稀釋集落形成單位(colony forming unit, CFU)至2×106/mL，備用。

2.2 BAEP對(duì)白念珠菌的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)及抑制50%生物膜的最低抑制濃度(sessile minimal inhibitory concentration，SMIC50)的測(cè)定 按照文獻(xiàn)[8]方法，取100 μL菌液(CFU 2×103/mL)與100 μL終濃度分別為32、64、128、256、512、1 024 μg/mL BAEP及0.5、1、2 μg/mL FLZ于96孔板中混合，另設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照孔，于37 ℃培養(yǎng)48 h后，以肉眼觀察不到菌落的最低藥物稀釋度為MIC，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次。

取CFU為2×106/mL的菌液100 μL，與100 μL終濃度分別為32、64、128、256、512、1 024 μg/mL BAEP及64、128、256 μg/mL FLZ于96孔板中混合，另設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照孔，37 ℃培養(yǎng)24 h后，每孔中加入50 μL XTT-維生素K3溶液，避光孵育2 h。使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm處各孔的吸光度(optical density, OD)值。與空白組比較，以O(shè)D值降低50%的藥物濃度為SMIC50。SMIC50的測(cè)定實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2.3 固體培養(yǎng)基上觀察BAEP對(duì)白念珠菌菌落形態(tài)的影響 按文獻(xiàn)[9]方法配制沙氏固體培養(yǎng)基，加入終濃度為256、512、1 024 μg/mL的BAEP，另設(shè)不含藥物的空白對(duì)照組。用倍比稀釋法將白念珠菌懸液中CFU稀釋至20/mL，取100 μL于固體培養(yǎng)基上，用稀釋涂布法涂布均勻。37 ℃培養(yǎng)6 d后，以數(shù)碼相機(jī)拍攝菌落形態(tài)。

2.4 倒置顯微鏡下觀察白念珠菌酵母生物膜形態(tài) 取CFU為2×106/mL的菌液1 mL，與1 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg/mL BAEP及64 μg/mL FLZ于6孔板中混合，另設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照孔，37 ℃培養(yǎng)24 h后，以倒置顯微鏡拍攝生物膜形態(tài)[8]。

2.5 熒光顯微鏡下觀察白念珠菌生物膜活性 取CFU為2×106/mL的菌液1 mL，與1 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg/mL BAEP及64 μg/mL FLZ于6孔板中混合，另設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照孔，37 ℃培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，之后加入100 μg/mL的FDA熒光染料溶液，避光37 ℃染色30 min，以熒光顯微鏡拍攝生物膜形態(tài)。

2.6 掃描電鏡下觀察白念珠菌生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu) 取CFU為 2×106/mL菌液2 mL與2 mL終濃度分別為256、512、1 024 μg/mL BAEP及64 μg/mL FLZ混合置于6孔板，另設(shè)不含藥物的陰性對(duì)照孔，分別放入經(jīng)高溫滅菌處理的硅橡膠導(dǎo)管，恒溫37 ℃培養(yǎng)24 h后，將導(dǎo)管取出，置2.5%戊二醛中，避光4 ℃放置2 h，依次置于35%、50%、75%、95%、100%乙醇逐級(jí)脫水各10 min，經(jīng)室溫過(guò)夜干燥后，經(jīng)HVS-GB型真空蒸鍍儀噴金，用掃描電鏡觀察拍照。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)檢測(cè)白念珠菌生物膜特異性基因的轉(zhuǎn)錄水平 ①RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄：CFU為2×106/mL的菌液2 mL與2 mL終濃度分別為1 024、512、256 μg/mL BAEP混合，37 ℃共培養(yǎng)24 h后，離心，收集菌體，用無(wú)菌PBS洗2次后進(jìn)行RNA的提取(參照MagExtractor-RNA試劑盒說(shuō)明書操作)。②引物的設(shè)計(jì)與合成：委托上海生工合成引物。ACT1的正向引物(5′→3′)為GCTGAACGTATGCAAAAGGAA，反向引物(3′→5′)為TGTGGTGAACAATGGATGGA；ALS1的正向引物為CACCAAACTACACGGTTAC，反向引物為ATAATGAGGACGGGAAAA；HWP1的正向引物為TGACTATCCACAACAGCCACAAGAAC，反向引物為GTCACAAGGAACACTAGGTTGAGGAG。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：采用SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒，配制PCR反應(yīng)體系25 μL，反應(yīng)在ABI7 500熒光定量PCR儀器上進(jìn)行，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析分別測(cè)定目的基因ALS1、HWP1和內(nèi)參基因ACT1的Ct值，實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。采用2-ΔΔCt法[10]檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄水平。

3 結(jié)果

3.1 BAEP對(duì)白念珠菌SC5314的MIC和SMIC50BAEP對(duì)白念珠菌菌落吸光度有明顯影響，并且隨BAEP濃度升高，白念珠菌菌落OD明顯降低；BAEP對(duì)白念珠菌SC5314的MIC是1 024 μg/mL，1 024 μg/mL BAEP對(duì)白念珠菌生物膜的抑制率可達(dá)60%以上，128、256、512 μg/mL BAEP抑制生物膜效果明顯。

3.2 BAEP對(duì)白念珠菌在固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的影響 觀察固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組菌落出現(xiàn)大量褶皺，邊緣不光滑，256 μg/mL BAEP組出現(xiàn)大量褶皺，邊緣不光滑，邊緣不光滑程度小于空白對(duì)照組；512 μg/mL BAEP組表面出現(xiàn)少量褶皺，邊緣略光滑，1 024 μg/mL組表面光滑，邊緣光滑。見圖1。

注：A.空白對(duì)照組；B. 256 μg/mL BAEP組；C. 512 μg/mL BAEP組；D. 1 024 μg/mL BAEP組

圖1各組白念珠菌在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

(上行圖片：1倍大??；下行圖片：倒置顯微鏡下觀察，10×40倍)

3.3 倒置顯微鏡下BAEP對(duì)白念珠菌生物膜形態(tài)的影響 倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組出現(xiàn)大量菌絲，F(xiàn)LZ組未發(fā)現(xiàn)明顯菌絲，256 μg/mL BAEP組菌絲數(shù)量較陰性對(duì)照組有所減少，512 μg/mL BAEP組更進(jìn)一步減少，1 024 μg/mL BAEP組不僅菌絲數(shù)量明顯減少，且長(zhǎng)度也明顯縮短。見圖2。

3.4 熒光顯微鏡下BAEP對(duì)白念珠菌生物膜活性的影響 經(jīng)FDA染色，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組因真菌活力最高，熒光最強(qiáng)；FLZ組熒光強(qiáng)度最弱；256、512、1 024 μg/mL BAEP組白念珠菌的活性、熒光強(qiáng)度隨藥物濃度遞增而減弱。見圖3。

3.5 掃描電鏡下BAEP對(duì)白念珠菌生物膜形態(tài)的影響 掃描電鏡結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的白念珠菌生物膜由密集的縱橫交錯(cuò)的菌絲構(gòu)成，256 μg/mL BAEP對(duì)白念珠菌生物膜的抑制效果并不明顯，512 μg/mL BAEP有一定抑制作用，1 024 μg/mL BAEP對(duì)白念珠菌生物膜有明顯的抑制作用，未見構(gòu)成生物膜的主要組分即菌絲。見圖4。

3.6 BAEP對(duì)白念珠菌生物膜相關(guān)基因表達(dá)的影響 256 μg/mL HAEP顯著下調(diào)HWP1基因的表達(dá)水平(P<0.05)，顯著上調(diào)ALS1基因的表達(dá)水平(P<0.05)，而512 μg/mL HAEP對(duì)ALS1和HWP1基因的表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P>0.05)。見表1。

表1 BAEP對(duì)白念珠菌生物膜ALS1、

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與FLZ組比較，#P<0.05；與256 μg/mL BAEP組比較，△P<0.05

4 討論

近年來(lái)，隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫制劑的廣泛使用，外科介入療法的不斷增多，免疫功能低下患者不斷增多，真菌尤其是深部真菌感染的發(fā)生率日漸增高，其中以白念珠菌的感染最為常見[12]。

在自然界以及人體中，白念珠菌往往以生物膜狀態(tài)形式存在。不同于單個(gè)的浮游菌體，生物膜是菌體不可逆地粘附在無(wú)活力物體或活組織表面形成的一個(gè)由自身產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)包裹菌體集群體[13]。白念珠菌生物膜主要由大量菌絲及其分泌的基質(zhì)所組成，生物膜對(duì)所包裹的菌體形成一種保護(hù)，使其對(duì)臨床上目前所用的抗真菌藥物高度耐受[14]。因此，近年來(lái)針對(duì)白念珠菌生物膜狀態(tài)的藥物研發(fā)成為藥學(xué)和真菌學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)有的抗真菌西藥不僅研發(fā)周期長(zhǎng)，且對(duì)人體的毒性和不良反應(yīng)也較大，故而從中藥中篩選發(fā)現(xiàn)抗生物膜活性的藥物成為一個(gè)重要渠道。本課題組前期研究表明，中藥及其有效成分具有良好的抑制白念珠菌作用[15-16]。

已有研究表明，中藥桑黃具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、抗肝纖維化、抗氧化、降血糖、消炎抗菌等藥理作用[17]。本實(shí)驗(yàn)采用XTT還原法測(cè)試BAEP對(duì)白念珠菌生物膜形成能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1 024 μg/mL的BAEP可以抑制白念珠菌60%生物膜形成能力。在固體培養(yǎng)基上，對(duì)照組菌落邊緣不光滑，大量褶皺，512 μg/mL BAEP組菌落有少量褶皺，邊緣略光滑；1 024 μg/mL BAEP組菌落表面光滑，邊緣光滑。這說(shuō)明BAEP對(duì)白念珠菌生物膜的形成有一定的抑制作用。

注：A.空白對(duì)照組；B.FLZ組；C.256 μg/mL BAEP組；D.512 μg/mL BAEP組；E.1 024 μg/mL BAEP組

注：A. 空白對(duì)照組；B. FLZ組；C.256 μg/mL BAEP組；D.512 μg/mL BAEP組；E.1 024 μg/mL BAEP組

注：A. 空白對(duì)照組；B.FLZ組；C.256 μg/mL BAEP組；D.512 μg/mL BAEP組；E.1 024 μg/mL BAEP組

倒置顯微鏡下觀察到空白對(duì)照組生物膜較厚，菌絲密集；256、512 μg/mL BAEP組生物膜較厚，但小于空白對(duì)照組；1 024 μg/mL BAEP組菌絲較少且長(zhǎng)度也明顯縮短，生物膜不明顯。結(jié)果說(shuō)明BAEP對(duì)白念珠菌生物膜的形成有一定的抑制作用。

FDA是一種用于細(xì)胞活力測(cè)定的熒光載體。只能染活細(xì)胞，且細(xì)胞活力越強(qiáng)，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)[18]。在本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度的BAEP作用后的生物膜經(jīng)FDA染色后，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度最高，并且隨著BAEP濃度遞增，熒光強(qiáng)度逐漸減弱。這說(shuō)明在BAEP 的作用下白念珠菌活力減退，故被FDA染色后熒光強(qiáng)度較弱。

掃描電鏡結(jié)果顯示，1 024 μg/mL BAEP對(duì)白念珠菌生物膜有明顯的抑制作用，主要表現(xiàn)在抑制其菌絲的形成。

白念珠菌生物膜形成受相應(yīng)的基因調(diào)控。HWP1與ALS1是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的參與白念珠菌生物膜形成的基因。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BAEP明顯降低HWP1的表達(dá)水平，但同時(shí)上調(diào)ALS1的表達(dá)水平。這可能是白念珠菌受到環(huán)境壓迫(本研究中的藥物BAEP)時(shí)采取的一種本能性的代償反應(yīng)。

本研究表明，BAEP對(duì)白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用，抗菌效果明確，但其抗菌的有效組分以及詳細(xì)的作用機(jī)制尤其是體內(nèi)的抗真菌作用尚有待于進(jìn)一步深入研究，這將為拓寬桑黃潛在的臨床用途提供一定的科學(xué)依據(jù)。