三種山蒼子精油化學(xué)成分及抑菌效果差異分析

王 雪，梁曉潔，高 暝，吳立文，汪陽東，陳益存

中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，杭州 311400

山蒼子是樟科(Lauraceae)木姜子屬(Litsea)多種植物的統(tǒng)稱，中國近50種，其中作為“芳香油料樹”被管理及廣泛栽培的主要有3種，即毛葉木姜子(Litseamollis)(俗稱大木姜)、山雞椒Litseacubeba(Lour.) Pers.(俗稱小木姜)及其變種毛山雞椒(Litseacubebavar.formosana)[1]。山蒼子主要分布在亞洲東部，中國、馬來西亞等，大洋洲和太平洋諸島[2]，中國主要分布在長江以南的各省份，居于海拔500～3 200米的疏林或林中路旁，通常是森林植被破壞后的先鋒樹種。作為我國重要的經(jīng)濟香料樹種之一，山蒼子果實可入藥(蓽澄茄)，用于治療腸胃不適和呼吸道等疾病，亦可作為食品中的添加劑以及化妝品的抗氧化和增香劑。山蒼子精油主要從果實中提取，淡黃色、不溶于水、高度揮發(fā)，具強烈的芳香氣味，已被國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于食品中(GB 2760-86)，并被廣泛用作化妝品的香料增香劑[3]。

近年來，隨著人們環(huán)保意識的增強，天然抑菌產(chǎn)品需求增大，也激起了國內(nèi)外科學(xué)家對植物精油抗菌特性的興趣[4]。早在1999年，植物精油就被認(rèn)為是合成食品添加劑和作物保護物質(zhì)的安全替代品[5]。此外，部分植物精油具有抗蟲、抑制植物病原體的作用[6]。

迄今為止，大量文獻報道了山蒼子精油的抗菌特性。在食品防腐方面，山蒼子精油對副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)具有顯著的抑菌活性[4]。在藥用和農(nóng)產(chǎn)品保護方面，山蒼子精油對黃曲霉(Aspergillusavus)有很強的抗菌活性，能夠抑制菌絲生長和改變其超微結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是一種安全的天然植物保護劑?；趯嶒炇倚∈蠛痛笫蟮倪z傳毒性試驗，山蒼子精油對人類的安全性得到證實[4]。大量研究表明，山蒼子精油具有廣譜抑菌性[7]，是一種不可缺少的天然抗菌材料，具有巨大的應(yīng)用潛力和推廣價值。但大部分研究未對山蒼子進行具體物種鑒定，所研究和推廣的山蒼子精油是山雞椒、毛葉木姜子和毛山雞椒果實精油的混合產(chǎn)物，亟待對這三種山蒼子精油品質(zhì)進行評價。

為鑒定三種山蒼子抑菌效果差異，我們選擇了十大植物病原真菌代表種尖孢鐮刀菌[8]，以及食源性疾病的常見致病菌大腸桿菌(Escherichiacoli)和李斯特菌[9]。作為抑菌實驗對象，分別檢測山雞椒、毛葉木姜子和毛山雞椒三個物種的精油抑菌活性，同時精油化學(xué)成分檢測和抑菌活性相關(guān)性分析，最終對三種山蒼子精油進行評價，為山蒼子遺傳育種和開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 植物材料

三種山蒼子分別從貴州、福建、安徽、重慶、江西和浙江收集到的優(yōu)良單株，經(jīng)丁炳楊教授鑒定分別為山雞椒、毛葉木姜子和毛山雞椒。收集的優(yōu)良單株的種子種植在貴州黎平的實驗基地。于2017年8～9月從試驗基地采集每種山蒼子樹齡3年的5個家系的果實作為生物學(xué)重復(fù)，通過水蒸餾法獲得山蒼子精油，三種山蒼子信息以及果實精油含量如表1所示。

表1 三種山蒼子各樣本果實精油信息統(tǒng)計表Table 1 The information statistics list of fruit essential oil in samples of May Chang tree

續(xù)表1 (Continued Tab.1)

樣本名稱Sample name精油含量Essential oil content(%)種名稱 Species name拉丁名Latin name采集日期 Harvest timeF81.82毛山雞椒L.cubeba var.formosana2017.8.16F101.83毛山雞椒L.cubeba var.formosana2017.8.17F111.85毛山雞椒L.cubeba var.formosana2017.8.17

1.1.2 供試病原菌

枯萎病病原菌(Fusariumoxysporumf.sp.fordii1)取自油桐枯萎病病發(fā)區(qū)，病原菌經(jīng)分離、純化后，形態(tài)和分子鑒定[10]。大腸桿菌和李斯特菌由浙江科技大學(xué)宋大峰博士贈送。

1.1.3 儀器與設(shè)備

設(shè)備： Agilent-5975B氣質(zhì)聯(lián)用儀

儀器：精油提取裝置、壓力蒸汽滅菌鍋、干熱滅菌器、電熱恒溫培養(yǎng)箱、旋渦混合器、微波爐、超凈工作臺、移液器、單反相機等。

1.2 實驗方法

1.2.1 山蒼子果實精油提取

取新鮮山蒼子果實，通過水蒸氣蒸餾法分離得到芳香精油。經(jīng)無水硫酸鈉(Na2SO4)干燥后于4 ℃保存?zhèn)溆?。各樣本單獨提取?/p>

1.2.2 三種山蒼子各樣本精油揮發(fā)性成分測定

利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)，分別對上述山蒼子各樣本精油進行揮發(fā)性成分檢測。吸取50 μL精油，溶解在5 mL無水乙醇溶液中，經(jīng)過無水硫酸鈉脫水處理后，上機測定。

GC-MS條件：色譜柱：DB-5MS(60 m×0.25 mm ID×0.25 μm膜厚)。程序升溫參數(shù)：初始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升溫至870 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至180 ℃保持1 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃保持5 min，最后以20 ℃/min升溫至250 ℃保持3 min。進樣口溫度：220 ℃，分流比1∶10，進樣量1 μL ，載氣為高純氦氣(99.999%)，柱流速：1.5 mL/min。色譜-質(zhì)譜接口溫度：250 ℃。離子源溫度：230 ℃。離子化方式：EI。電子能量：70 eV。掃描質(zhì)量范圍m/z50～500。

定性與定量分析：各組分分別與NIST08標(biāo)準(zhǔn)譜庫進行檢索匹配，并結(jié)合文獻報道、各成分相對保留時間等進行定性分析。定量分析按峰面積歸一化法計算各峰面積的相對含量。

1.2.3 山蒼子精油抑制真菌活性測定

1.2.3.1 精油使用液的配制

用二甲基亞砜(DMSO)溶解待測精油，每種待測精油用量設(shè)置5個濃度梯度，分別為6.25、12.5、25、50和100 μL/mL。

1.2.3.2 抑菌率的測定

采用生長速率法測定山蒼子精油對尖孢鐮刀菌的抑菌活性。將配制好的PDA培養(yǎng)基分裝到組培瓶中，每瓶倒入60 mL，待冷卻至 55 ℃左右時，各加入 600 μL的精油使用液，立刻搖勻?；靹蚝蟮谷氲?個90 mm規(guī)格的培養(yǎng)皿中，制成含不同濃度精油的平板。用滅菌的9 mm打孔器在培養(yǎng)好的尖孢鐮刀菌平板上打取菌餅，用鑷子將菌餅倒貼于上述平板上，28℃培養(yǎng)，分別在 72、96、120、144和168 h按十字交叉法測量菌落直徑。

菌絲生長抑制率=(對照菌落直徑 - 處理菌落直徑)/(對照菌落直徑 - 菌餅直徑 )×100%

1.2.4 山蒼子精油抑制細(xì)菌活性測定

采用抑菌圈法測定山蒼子精油對大腸桿菌和李斯特菌的抑菌活性。將大腸桿菌培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，制備1×107CFU/mL的菌懸液。吸取100 μL菌懸液與5 mL半固體LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂7.5 g，蒸餾水1 000 mL)混勻后倒入9 mm培養(yǎng)皿中，冷卻后形成半固體培養(yǎng)基。將含有20 μL精油使用液的圓形濾紙(直徑為5 mm)放入培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)基中均勻放置3個精油濾紙。于37 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑。李斯特菌需在腦心浸液肉湯培養(yǎng)基(BHI)中培養(yǎng)，其余實驗方法同上。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均保留3～5個重復(fù)，利用Excel計算各精油不同濃度不同培養(yǎng)時間下的抑菌率，繪制毒力方程并計算出半最大效應(yīng)濃度(EC50)和最低抑菌濃度(MIC)數(shù)值。通過DPS(Data Processing System)軟件，對三種山蒼子精油抑菌效果進行顯著性分析，對各化學(xué)成分與抑菌效果進行相關(guān)性分析。采用最小顯著性差異檢驗(LSD)[11]進行方差分析(ANOVA)。利用SPSS軟件進行相關(guān)性分析，通過R語言(https://www.r-project.org/)corrplot包中的“corrplot()”函數(shù)進行相關(guān)矩陣分析和可視化作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子物種鑒定

對采集到的山蒼子進行性狀描述并記錄，與《中國植物志修訂版》(http://foc.eflora.cn/)和中國植物圖像庫(PPBC http://www.plantphoto.cn/)進行對比，確定其為山雞椒、毛葉木姜子和毛山雞椒。還有一未鑒定種，推測其為山雞椒和紅葉木姜子雜交種或變種，在本實驗中不做具體研究。以下列出了這些山蒼子的植物檢索表(表2)。

表2 幾種重要山蒼子物種檢索表Table 2 The plant key of several important May Chang tree species

2.2 山蒼子精油對真菌的抑菌性評估

采用十字交叉法測定了山蒼子精油不同濃度下從第3天到第7天的菌落直徑，再根據(jù)菌落直徑數(shù)據(jù)計算出各個樣本的菌絲生長抑制率?？偟膩碚f，山蒼子精油具有較好的抑菌效果，在濃度為1 000 μL/L時，除了F15、C14和F11，其余樣本抑菌率都達(dá)到了100%。大部分樣本精油在濃度為500 μL/L時，抑菌率在90%以上。表3展示了不同樣本精油的毒力，其中毒力方程是根據(jù)濃度對數(shù)和抑菌率的相關(guān)性，做出的回歸方程。根據(jù)毒力方程，當(dāng)y值為1時，x所對應(yīng)的濃度就是最低抑菌濃度(MIC)；當(dāng)y值為0.5時，x所對應(yīng)的濃度就是半最大效應(yīng)濃度(EC50)。其中，樣本G4、G3和L29精油的EC50最低，分別為0.47、63.32和91.06 μL/L；樣本G3、F7和F9精油的MIC最低，分別為265.53、243.13和321.07 μL/L。

表3 三種山蒼子各樣本精油對尖孢鐮刀菌的抑菌活性分析Table 3 The inhibitory activities of essential oil from three kinds of May Chang trees against Fof-1

2.3 三種山蒼子精油抑制真菌活性評價

尖孢鐮刀菌在培養(yǎng)到第7天后記錄菌落形態(tài)，發(fā)現(xiàn)山雞椒精油培養(yǎng)基中的菌落直徑最小，其次是毛葉木姜子和毛山雞椒。為進一步確定三種山蒼子精油對尖孢鐮刀菌的抑菌差異性，本研究對每個物種選擇3個家系的精油作為生物學(xué)重復(fù)進行精油含量、MIC和EC50分析。結(jié)果如表4所示，山雞椒精油含量為7.70%，顯著高于毛葉木姜子(3.09%)和毛山雞椒(2.14%)。山雞椒MIC和EC50濃度分別為499.44和54.88 μL/L，毛葉木姜子MIC和EC50分別為1479.10和110.21 μL/L，毛山雞椒MIC和EC50分別是638.72和149.19 μL/L，結(jié)果表明，山雞椒MIC顯著低于毛葉木姜子，EC50顯著低于毛山雞椒，證明山雞椒果實精油含量以及精油抑制真菌效果都顯著優(yōu)于其他兩個物種。

表4 山雞椒、毛葉木姜子和毛山雞椒精油對尖孢鐮刀菌抑菌效果的顯著性分析Table 4 The significant analysis on inhibitory effect of L.cubeba,L.mollis and L.cubeba var.formosana essential oil against Fof-1

注：*用小寫字母表示5%顯著性。如果一個處理為“a”，那么所有包含“a”的處理之間沒有顯著差異，而不包含“a”的處理之間存在顯著差異。

Note:*The lowercase letters are used for 5% significance.If one dispose is treated as “a”,there are no significant difference among all the treatments containing “a”,and there are significant differences among all treatments that do not include “a”.

2.4 三種山蒼子精油抑制細(xì)菌活性評價

為了進一步探究三種山蒼子對細(xì)菌的抑菌活性，本研究分別選擇3個家系精油作為生物學(xué)重復(fù)進行抑制大腸桿菌和李斯特菌效果的分析。三種山蒼子精油抑菌圈直徑如表5所示，結(jié)果顯示三種山蒼子精油對大腸桿菌和李斯特菌都表現(xiàn)出抑菌活性，特別是對大腸桿菌的抑菌活性優(yōu)于李斯特菌。根據(jù)抑菌圈試驗判定標(biāo)準(zhǔn) ：抑菌圈直徑大于 20 mm，極敏 ；16～20 mm，高敏 ；11～15 mm 中敏 ；8～10 mm，低敏 ；小于 8 mm，不敏感[12]。當(dāng)濃度為100 μL/mL時，大腸桿菌對山雞椒、毛葉木姜子和毛山雞椒都表現(xiàn)出對極敏感性；當(dāng)精油濃度為50 μL/mL時，對山雞椒和毛葉木姜子表現(xiàn)出極敏感性，毛山雞椒為高敏；濃度在25 μL/mL或以下時，大腸桿菌對三種山蒼子精油都表現(xiàn)出中敏或低敏感性。而李斯特菌在精油濃度為100 μL/mL時，對山雞椒表現(xiàn)出極敏感性，對毛葉木姜子和毛山雞椒表現(xiàn)出高敏和中敏感性；當(dāng)濃度為12.5 μL/mL時，對毛葉木姜子和毛山雞椒表現(xiàn)出低敏感性。整體上看，三種山蒼子精油對大腸桿菌的抑菌效果相近；山雞椒對李斯特菌的抑菌效果要優(yōu)于毛葉木姜子和毛山雞椒。

表5 三種山蒼子精油不同濃度下對大腸桿菌和李斯特菌的抑菌活性分析Table 5 The antibacterial activity of three kinds May Chang tree essential oil against E.coli and L.monocytogenes at different concentrations

2.5 山蒼子精油化學(xué)成分分析

本研究對三種山蒼子各樣本精油進行了GC-MS檢測，每個樣本鑒定得到的成分占總成分的97%以上。由于各樣本精油化學(xué)成分含量差異性較大，只對各物種的代表樣本進行展示。三種山蒼子精油成分的化學(xué)式和成分含量如表6所示，橙花醛和香葉醛是山雞椒、毛山雞椒和毛葉木姜子的最主要成分，其中山雞椒橙花醛和香葉醛的含量最高，分別占39.97%和50.00%。

表6 三種山蒼子精油化學(xué)成分及百分含量分析Table 6 The analysis of chemical compositions and percentage contents in three kinds May Chang tree essential oil

續(xù)表6(Continued Tab.6)

化學(xué)成分Chemical composition中文名稱Chinese name化學(xué)式Chemical formula含量Content(%)山雞椒L.cubeba毛山雞椒L.cubeba var.formosana毛葉木姜子L.mollis6-Octen-1-ol,3,7-dimethyl-,(R)-(R)-3,7-二甲基-6-辛烯醇C10H20O0.10Cyclohexanemethanol,4-hydroxy- .alpha.,.alpha.,4-trimethyl-對薄荷烷-1,8-二醇C10H20O20.10Caryophyllene石竹烯C15H240.481.430.61Caryophyllene oxide石竹烯氧化物C15H240.040.01(-)-β-Elemeneβ-欖香烯C15H26O0.63(E)-β-Farnesene (E)-法呢烯C15H26O0.05Naphthalene,decahydro-1,5-dimethyl-1,5-二甲基-十氫萘C11H180.044-terpene alcohols4-萜烯醇C11H20O0.052-Cyclohexen-1-one, 4-(2-oxopropyl)-4-(2-氧代丙基)-2-環(huán)己烯-1-酮C17H28O20.973-Cyclopentene-1-acetaldehyde,2-oxo-2-氧代-3-環(huán)戊烯-1-乙醛C18H24O20.255-Hepten-2-one甲基庚烯酮C6H10N20.150.050.39Cyclohexane,(1-methylethyl)-異丙基環(huán)己烷C9H180.13

注：“/”表示未檢測到。

Note:“/” indicates not detected.

2.6 山蒼子精油差異成分與抑菌效果相關(guān)性分析

為了進一步探究山蒼子精油化學(xué)成分與抑菌效果的關(guān)系，本研究對各樣本山蒼子精油差異成分與MIC進行了初步的相關(guān)性分析。結(jié)果如表7所示，香葉醛與MIC呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，橙花醛與MIC呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，石竹烯與MIC呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，其余各成分與MIC的相關(guān)性較低。相關(guān)性分析結(jié)果表明，山蒼子精油中香葉醛和橙花醛含量與抑菌效果呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，石竹烯含量與抑菌效果存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。

表7 山蒼子精油差異成分與最低抑菌濃度的相關(guān)性分析Table 7 The correlation analysis between the chemical components of essential oil and MIC

續(xù)表7(Continued Tab.7)

中文名稱Chinese name英文名稱English name最低抑菌濃度 MIC皮爾遜相關(guān)性Pearson correlation 顯著系數(shù)Significance coefficient 個案數(shù)Number of case桉葉油素Eucalyptol0.4610.2514胡椒酮Piperitone0.8050.194-萜烯醇3-Cyclohexen-1-ol,4-methyl-1-(1-methylethyl)--0.0240.9699茨醇Borneol-0.2410.6969環(huán)氧蒎烷3-Oxatricyclo [4.1.1.0(2,4)] octane,2,7,7-trimethyl-0.0010.9989石竹烯Caryophyllene0.800??0.0115石竹烯氧化物Caryophyllene oxide0.7460.08810檸檬二乙縮醛Citral diethyl acetal0.8750.0529

注：*P< 0.05；**P< 0.01。

Note:*P< 0.05;**P< 0.01.

根據(jù)對山蒼子精油差異成分與MIC的相關(guān)性分析，本研究進一步篩選出山蒼子精油中的幾種主要成分進行各成分、抑菌率以及精油含量之間的相關(guān)性分析。山蒼子精油主要的化學(xué)成分為檸檬醛(橙花醛+香葉醛)、檸檬烯、石竹烯、香茅醛、芳樟醇和松油醇(表6)，將這6種主要成分與菌絲生長抑制率和精油含量進行相關(guān)性分析。如圖1所示，檸檬醛和芳樟醇含量與抑菌率呈現(xiàn)顯著(顯著性水平α=0.05)正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.342和0.333；檸檬醛含量與精油含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.391；檸檬烯和石竹烯含量與檸檬醛的含量呈現(xiàn)極顯著(顯著性水平α=0.01)負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為-0.496和-0.664。

圖1 山蒼子精油主要化學(xué)成分、精油抑制率和精油含量之間的相關(guān)性分析Fig.1 The correlation analysis among the main chemical components of essential oil,inhibition rate and essential oil content. 注：* P < 0.05；** P < 0.01。Note:* P < 0.05;** P < 0.01.

3 結(jié)論

3.1 山雞椒、毛葉木姜子和毛山雞椒精油抑菌性效果評價

本研究中山蒼子精油具有廣譜的抑菌性，與文獻報道[7]一致，特別是山雞椒精油抑制真菌的效果最好，其EC50為54.88 μL/L。毛葉木姜子和毛山雞椒精油的EC50均低于先前報道[13](EC50=379.4 mg/L)。山雞椒和毛山雞椒精油的MIC分別為499.44和638.72 μL/L，均低于先前報道[14]的山蒼子精油抑制真菌的 MIC(1 000 μL/L)。此外，山雞椒精油在濃度為125 μL/L時，對尖孢鐮刀菌的抑菌率大于50%，異樟葉(異一橙花叔醇)精油被報道濃度在166 μL/L時抑菌率為42.64%，山雞椒精油抑制尖孢鐮刀菌的效果要優(yōu)于異樟葉抑菌效果[15]。如表5所示，山蒼子精油對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的抑制效果優(yōu)于對革蘭氏陽性菌(李斯特菌)，這與Mayaud等[16]先前的結(jié)論不同，但與Kumarsaikia等[17]報道的結(jié)論一致。三種山蒼子精油對大腸桿菌表現(xiàn)出相近且較好的抑菌效果，而山雞椒精油對李斯特菌的抑制效果要優(yōu)于毛葉木姜子和毛山雞椒?？傮w來說，山雞椒精油含量和抑菌效果都優(yōu)于毛葉木姜子和毛山雞椒，證明山雞椒可作為山蒼子品質(zhì)油提取和生產(chǎn)的優(yōu)良物種，亦可作為抗菌和防腐產(chǎn)品研發(fā)的原材料。

3.2 山蒼子精油成分與抑菌效果相關(guān)性分析

本研究中山蒼子揮發(fā)油化學(xué)成分中檸檬醛、檸檬烯、石竹烯、香茅醛、芳樟醇和松油醇為其最主要的化學(xué)成分，特別是檸檬醛含量(70%～90%)，這與先前報道具有一致性[18]。在山蒼子精油差異成分與MIC的顯著性分析中，結(jié)果顯示只有檸檬醛與MIC呈顯著負(fù)相關(guān)，即與抑菌性成顯著正相關(guān)；但通過與菌絲生長抑制率進行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)檸檬醛和芳樟醇與抑菌性有顯著正相關(guān)關(guān)系。推測芳樟醇與抑菌性存在較高的正相關(guān)關(guān)系，但由于山蒼子精油中檸檬醛含量占據(jù)主導(dǎo)地位，導(dǎo)致不同指標(biāo)下其相關(guān)關(guān)系的顯著性存在一定差異。據(jù)報道，單萜檸檬醛和香茅醛已被證明能夠抑制真菌的生長，尤其是檸檬醛[19]；芳樟醇R-和S-對映異構(gòu)單體都具有較好的體外抗菌活性[20]。實驗結(jié)果支持檸檬醛和芳樟醇含量可作為山蒼子揮發(fā)油抗真菌活性樣本篩選的可靠指標(biāo)，其中檸檬醛含量為主導(dǎo)。本研究中石竹烯含量與抑菌率表現(xiàn)出顯著負(fù)相關(guān)，但Kim等[21]探究了石竹烯異構(gòu)體的抗菌活性，證明它們可以抑制金黃色鏈球菌(Streptococcusaureus)和副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)。石竹烯在山蒼子精油中與檸檬醛含量顯著負(fù)相關(guān)，推測其可能與檸檬醛合成存在直接或間接地競爭關(guān)系。