鞘蕊蘇赤霉素氧化酶基因的克隆及表達(dá)研究△

黃曉，張?zhí)瘢R朝芝，劉焱文，余坤*，黃必勝*

1.湖北中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 中藥資源中心，北京 100700

鞘蕊蘇藥材的基原植物為毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii(Wild.)Briq.，主產(chǎn)于印度，在中國(guó)云南、福建亦有分布，被植物學(xué)家界定為珍稀植物[1]。鞘蕊蘇以全草入藥，民間主要用于治療哮喘[2]、咳嗽等疾患，療效很好[3]。鑒于鞘蕊蘇良好藥效作用，本實(shí)驗(yàn)室與企業(yè)實(shí)施產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，以鞘蕊蘇為君藥，開(kāi)發(fā)了鞘蕊蘇膠囊。現(xiàn)代科學(xué)研究表明，鞘蕊蘇有效成分為二萜類(lèi)化合物異佛司可林(isoforskolin)[4]。

萜類(lèi)化合物以5碳異戊二烯(IPP)及其異構(gòu)體二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)為原料[5]，通過(guò)異戊二烯轉(zhuǎn)移酶催化連接而成。IPP和DMAPP以“頭-尾”方式相連形成牻牛兒基焦磷酸(GPP)[6]，通過(guò)法尼基焦磷酸合成酶(FPS)的作用，GPP與1分子IPP結(jié)合形成法尼基焦磷酸(FPP)[7]，再通過(guò)牻牛兒基焦磷酸合成酶(GGPPS)作用，F(xiàn)PP與1分子IPP形成牻牛兒基焦磷酸(GGPP)[8]，GGPP是二萜化合物的前體物質(zhì)。本研究通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆得到赤霉素氧化酶基因，并成功地構(gòu)建了基因的表達(dá)載體。通過(guò)對(duì)GA氧化酶基因的克隆及表達(dá)載體構(gòu)建，研究二萜類(lèi)化合物的合成途徑中相關(guān)酶的功能，為提高湖北通城種植鞘蕊蘇藥材中異佛司可林含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料

鞘蕊蘇植物移植自湖北省通城縣鞘蕊蘇藥材集中種植基地，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室吳和珍教授鑒定為唇形科植物毛喉鞘蕊花Coleusforskohlii(Willd.)Briq.，將其植株種植于實(shí)驗(yàn)室，保證植株健康的生理狀態(tài)，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要。

pMD18-T Vector(大連寶生物科技有限公司)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根生化科技有限公司)，PGEX-4T-1表達(dá)載體(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所陳士林課題組贈(zèng)予)，QIAGEN RNeasy Plant Mini試劑盒(QIAGEN技術(shù)有限公司)，質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，3′-FμLl RACE試劑盒、LaTaq酶、DNA Marker(TaKaRa公司)，2×EasqTaqMix(北京全式金生物技術(shù)公司)，Hind Ⅲ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶、PrimeScripTM 1stStrand cDNA synthesis Kit.SYBR PrimeScripTM RT-PCR Kit、Primer start Gxl高保真酶、DNA Marker(TaKaRa 公司)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 鞘蕊蘇赤霉素CfGA01全長(zhǎng)的克隆

步驟1：選取高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果中的赤霉素氧化酶基因片段，設(shè)計(jì)5′引物(CfGAS-outer TCTGGCGGCACTGAAATCCA，CfGAS-inner CCAGA-ATCTCGCACGCCATCTT)、3′引物(CfGAS-outer CTTGTGGTAGTTAGAATGGGC，CfGAS-inner TTGAAGA-AGCCCACCTCCT)進(jìn)行巢氏RACE實(shí)驗(yàn)，得到基因全長(zhǎng)序列。

步驟2：利用DNAMAN軟件根據(jù)全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)引物，并引入酶切位點(diǎn)(CfGAS-F-EcoR I gaattcACAACCACCACCAACACTCATCTCTCT，CfGAS-R-SalⅠgtcgacACCGGATGGAAGGGAGGGAACATTA)，用高保真DNA聚合酶擴(kuò)增全長(zhǎng)，反應(yīng)體系(Prime star Gxl Polymerase 1 μL、5×Prime star Gxl Buffer 10 μL、F 1 μL、R 1 μL、cDNA 5 μL、dNTP Mixture 4 μL、RNase free dH2O 28 μL)，PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃冷卻，待反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物取出置于4 ℃保存。分別用EcoR I、SalⅠ對(duì)提取的重組質(zhì)粒與表載體PFEX-4T-1進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系(質(zhì)粒/PFEX-4T-1 10 μL、10×K Buffer 5 μL、酶1 1 μL、酶2 1 μL、RNase free dH2O 33 μL)，反應(yīng)條件：37 ℃反應(yīng)3～8 h，65 ℃水浴15 min滅活限制性內(nèi)切酶。

步驟3：用T4連接酶將載體和質(zhì)粒雙酶切后的產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到帶有目的基因的重組質(zhì)粒，具體反應(yīng)體系及條件如下：連接酶T4 1 μL、10×T4Buffer 1 μL、載體膠回收產(chǎn)物4 μL、質(zhì)粒膠回收產(chǎn)物4 μL，反應(yīng)條件：16 ℃空氣浴連接3 h以上，取10 μL連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到100 mL DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，pcr篩選陽(yáng)性克隆，并將陽(yáng)性克隆送于生工測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果作比對(duì)后選取準(zhǔn)確無(wú)誤的陽(yáng)性單克隆2～4個(gè)，于37 ℃恒溫?fù)u菌培養(yǎng)過(guò)夜，用以提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒取少量做雙酶切驗(yàn)證，剩余的-20 ℃保存，表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)束，挑取陽(yáng)性單克隆至2 mL的無(wú)菌EP管中，LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h作為母菌，并加入40%甘油混勻，于-80 ℃保存[9]。

2.2 實(shí)時(shí)熒光相對(duì)定量PCR

利用百泰克多糖多酚植物總RNA抽提試劑盒提取鞘蕊蘇根、莖、葉和花各個(gè)組織的總RNA，然后分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)通過(guò)波長(zhǎng)(A)檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和濃度。利用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit試劑盒將上述RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，利用TaKaRa公司的SYBR premix ExTaqkit試劑盒在Roche公司Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量?jī)x上進(jìn)行qPCR。

2.3 CfGA01基因功能驗(yàn)證

將重組表達(dá)載體與空載體PGEX-4T-1轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，含空載體的大腸桿菌將被用作對(duì)照菌，利用IPTG誘導(dǎo)啟動(dòng)子在大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中表達(dá)萜類(lèi)合成酶基因，并確定蛋白表達(dá)的最佳IPTG濃度、最佳時(shí)間和最佳溫度。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA提取

通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(1.0%)檢測(cè)鞘蕊蘇根部和葉中提取的總RNA，觀察是否能清楚地看到28 s和18 s的條帶，由圖1觀察條帶清晰可見(jiàn)。將跑膠后的總RNA溶液用Nanodrop2000檢測(cè)濃度和純度，其A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm比值分別為2.01和2.13，表明有輕微降解，但它不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的正常過(guò)程。

圖1 鞘蕊蘇根和葉中提取的RNA的電泳圖

3.2 3′、5′-RACE擴(kuò)增

根據(jù)高通量測(cè)序片段設(shè)計(jì)GSP1和GSP2引物。通用3′引物和5′引物進(jìn)行巢式擴(kuò)增，通過(guò)研究不同的退火溫度，擴(kuò)增3′端和5′端得到與目標(biāo)片段大小一致的條帶。通過(guò)凝膠回收目的片段，并將目的片段的膠回收產(chǎn)物與PMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，菌落過(guò)夜生長(zhǎng)，通過(guò)PCR挑選陽(yáng)性克隆，選擇2～4個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)序。通過(guò)凝膠電泳發(fā)現(xiàn)CfGA013′端最佳退火溫度為62 ℃，5′端最佳退火溫度為50 ℃(見(jiàn)圖2)。

圖2 3′RACE、5′RACE凝膠電泳圖(由上到下)

3.3 鞘蕊蘇CfGA01基因全長(zhǎng)的拼接

測(cè)序結(jié)果用MEGA 6.0進(jìn)行拼接，DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行分析，比對(duì)結(jié)果顯示CfGA01基因的總長(zhǎng)度為1234 bp，包括5′非編碼區(qū)72 bp，993 bp開(kāi)放閱讀框區(qū)，169 bp 3′非編碼，終止密碼子為T(mén)AA。氨基酸數(shù)量為408，分子量為45 874，其中開(kāi)放閱讀框中的氨基酸數(shù)為355，分子量為39 606。見(jiàn)圖3。

3.4 CfGA01系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

山茶花Camellialipoensis、丹參SalviamiltiorrhizaBunge、牽?；↖pomoeanil、大麻Marahmacrocarpa、毛狀煙草Nicotianatomentosiformis、野生煙草N.attenuata、美花煙草N.sylvestris、煙草N.tabacum、矮牽牛Petuniaxhybrida、節(jié)節(jié)麥Aegilopstauschiisubsp.tauschii、小麥Triticumaestivum植物的GAS蛋白進(jìn)行多重比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們具有較高的同源性(見(jiàn)圖4)。通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)CfGA01蛋白與丹參GA蛋白的親緣關(guān)系比較近。

3.5 qPCR分析

CFGA01參與赤霉素合成，赤霉素是植物中的二萜類(lèi)植物激素，能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)，對(duì)整個(gè)發(fā)育過(guò)程起著重要作用。圖5 qPCR結(jié)果表明CfGA01在根、莖、花和葉各個(gè)組織中都有分布，而分布于葉和花中相對(duì)較高。

3.6 原核蛋白表達(dá)分析

通過(guò)圖6 SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示，IPTG濃度為1 mol·L-1后，溫度為20 ℃時(shí)，在上清液中有表達(dá)，但表達(dá)較少，大量蛋白成為包涵體。

4 討論

赤霉素在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中起著重要作用，如種子萌發(fā)、葉芽生長(zhǎng)、葉柄伸長(zhǎng)、葉片擴(kuò)大、花形成和發(fā)育、果實(shí)成熟等都與赤霉素有著重要聯(lián)系。一般來(lái)說(shuō)赤霉素的合成主要發(fā)生在植物的頂端部位，即分生能力較強(qiáng)的部位，如頂芽、發(fā)育葉和根尖。近年來(lái)隨著植物功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，赤霉素研究取得重大進(jìn)展，特別是赤霉素生物合成途徑，起關(guān)鍵作用的酶基因已在許多植物中克隆出來(lái)，如在擬南芥、水稻、豌豆、玉米、西紅柿、草莓、萵苣、煙草、大麥和南瓜等植物中都發(fā)現(xiàn)了參與赤霉素合成與代謝的基因[10]，然而在鞘蕊蘇中相關(guān)基因報(bào)道較少。

本研究基于前期外源性GA處理植株有效成分含量減少的現(xiàn)象，首次克隆并表達(dá)了鞘蕊蘇中赤霉素氧化酶CfGA01，基因表達(dá)蛋白與煙草、小麥、丹參等的相似性都在80%以上，進(jìn)化關(guān)系與丹參最相近，表明該基因序列比較保守。在qPCR的實(shí)驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)鞘蕊蘇中赤霉素氧化酶在葉中表達(dá)量最多，而在根中表達(dá)量較少，這種表達(dá)趨勢(shì)不同于模式植物擬南芥和水稻的研究[11]，表明鞘蕊蘇中赤霉素氧化酶的合成及富集有其獨(dú)特性。在鞘蕊蘇不同組織中有效成分異佛司可林含量的研究中，發(fā)現(xiàn)葉中異佛司可林含量最低，而根中含量最高，這同赤霉素氧化酶的表達(dá)量正好相反。赤霉素與異佛司可林由共同的前提化合物經(jīng)過(guò)生物反應(yīng)得到，研究赤霉素氧化酶的功能，為研究異佛司可林的生物合成提供科學(xué)依據(jù)，為后續(xù)提高栽培鞘蕊蘇有效成分含量奠定基礎(chǔ)。

圖3 鞘蕊蘇CfGA01基因全長(zhǎng)序列圖

圖4 鞘蕊蘇CfGA01同源系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖5 CfGA01在鞘蕊蘇不同器官的相對(duì)表達(dá)量

圖6 PGEX-4T-1-CfGA01蛋白表達(dá)圖