外源NO對桔梗幼苗生長和總皂苷積累的影響△

張堅，李先寬，李興林，馬琳，陳志娟

1.天津中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，天津 301617；2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院/工業(yè)微生物教育部重點實驗室，天津 300457

桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A.DC.為桔梗科桔梗屬多年生草本植物，根為傳統(tǒng)中藥桔梗，具有祛痰功效。此外，桔梗還是一種集藥食兩用和觀賞于一身的植物，因此桔梗綜合應(yīng)用價值很高。隨著桔梗在我國需求量的不斷增加，野生桔梗資源遠遠不能滿足需求[1]，所以近年來很多研究者對桔梗人工栽培技術(shù)進行了研究[2]。一氧化氮(nitric oxide，NO)是一種普遍存在于生物體內(nèi)的具有生物活性和信號傳導(dǎo)作用的易擴散分子，對植物許多生命活動具有調(diào)節(jié)作用，很多研究表明NO對植物生長有促進作用，且對逆境脅迫下植物的生長具有改善作用[3-5]。目前有關(guān)外源性NO的促進桔梗生長和誘導(dǎo)桔梗體內(nèi)皂苷積累的研究還鮮有涉及，故本研究考察了外源性硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)對桔梗幼苗的生長和對幼苗中總皂苷誘導(dǎo)的影響，并對桔梗幼苗中脯氨酸(proline，Pro)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)等生理活性指標(biāo)進行測定，初步分析這一過程的生理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 當(dāng)年成熟桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq.)A.DC.種子，購于河北安國市場，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)馬琳教授鑒定為中藥桔梗種子，通風(fēng)干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑及藥品 桔梗皂苷D(上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：58479-68-8)，硝普鈉(天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司，分析純)，乙醇(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠，分析純)，甲醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純)，濃硫酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)，蒸餾水(自制)。

1.1.3 主要儀器 XMTB數(shù)顯調(diào)節(jié)恒溫水浴鍋(北京長風(fēng)儀器儀表公司)，752型可見-紫外分析儀(上海第三分析儀器廠)，XCA-80001電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市華北實驗儀器有限公司)，F(xiàn)A1004電子天平(天津市天馬儀器廠)，TDL-40B低速臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)，DDL-5低速冷凍離心機(杭州艾普儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 幼苗生長試驗 取成熟飽滿、大小一致的桔梗種子，用蒸餾水浸泡24 h，備用。用7個相同規(guī)格的穴盆(長54 cm，寬27 cm，高6 cm)，在每個穴里裝入等量的基質(zhì)[珍珠巖-蛭石-營養(yǎng)土(1∶1∶4)]，將桔梗種子播種在穴盆中，每格種5～8株。出苗后間苗，每盆留生長一致、分布均勻的幼苗。待幼苗長出4片真葉時進行SNP誘導(dǎo)。分別用濃度為0.03、0.05、0.07、0.10、0.50、1.00 mmol·L-1的SNP溶液進行誘導(dǎo)處理，每個處理設(shè)3個重復(fù)，蒸餾水組作為空白對照組(CK)。SNP溶液在處理時采用全株噴灑的方法，每次處理用量約100 mL，以澆透為止，處理時間為傍晚，1 d處理1次，共噴灑7 d。SNP處理7 d后測量植株長度，并測量生理指標(biāo)。

1.2.2 總皂苷含量 采用香草醛-硫酸顯色比色法測定桔?？傇碥蘸縖6]。具體方法：精確稱取3.8 mg桔梗皂苷D置10 mL容量瓶中，甲醇定容得對照品溶液。稱取對照品溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL置10 mL具塞試管中，水浴干燥后加入10%香草醛試液0.5 mL，60%硫酸4.5 mL，搖勻，于60 ℃水浴加熱15 min，冰水浴中冷卻3 min，以不加皂苷的樣品為空白對照，檢測波長470 nm，得回歸方程Y=241.58X-0.056 3(r=0.997 0)。然后，取桔梗幼苗(含胚軸的根部)干燥粗粉約1 g(精密質(zhì)量)，置索氏提取器中乙醚回流除雜后甲醇超聲提取2次，每次30 min，合并濾液后濃縮，然后進行香草醛-硫酸顯色反應(yīng)，470 nm波長測定樣品皂苷含量。

1.2.3 生理指標(biāo)測定 脯氨酸含量的測定采用酸性茚三酮顯色法，得回歸方程Y=0.021 6X-0.016 7(r=0.997 8)。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量(μmol·g-1)的測定采用硫代巴比妥酸法。保護酶活性的測定：用氮藍四唑(NBT)顯色法在A560 nm測定SOD活性,以將NBT的還原抑制到對照一半(50%)時所需的酶量為1個酶活單位(U·g-1)；用愈創(chuàng)木酚法測定POD的活性[7]，以每分鐘A470 nm增加0.01為1個酶活力單位(U·g-1·min-1)；CAT的活性測定采用紫外吸收法，以每分鐘內(nèi)A240 nm下降0.1為1個酶活力單位(U·g-1·min-1)。每個處理平行3次，取平均值。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，以Duncan’s新復(fù)級差法比較不同處理間的差異性，用Excel軟件進行制圖，Word文檔進行制表。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SNP對桔梗幼苗生長性狀的影響

NO是一種無色透明、結(jié)構(gòu)簡單、兼具脂溶性和水溶性的小分子生物自由基，可自由通過生物膜在植物體內(nèi)發(fā)揮作用[8]。NO被認(rèn)為是在植物體中普遍存在的關(guān)鍵信號分子[9]，適度的NO能夠促進植物的生長和發(fā)育[10]。本實驗中，SNP(NO供體)噴灑處理后，在短期內(nèi)(2 d之內(nèi))不會出現(xiàn)可見性誘導(dǎo)現(xiàn)象；處理第3天后出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)差異，首先表現(xiàn)在植株高度上。較低濃度的SNP有助于桔梗幼苗的生長，幼苗莖高和根長都較對照組(CK)明顯增長；隨著誘導(dǎo)時間增加，高濃度SNP(1.00 mmol·L-1)處理的桔梗幼苗出現(xiàn)脅迫傷害，外圍葉片已有部分枯萎，葉片出現(xiàn)黃化畸形現(xiàn)象；而低濃度SNP誘導(dǎo)下的新生小葉長勢良好，沒有明顯誘導(dǎo)傷害現(xiàn)象。表1為SNP處理7 d后幼苗的生長情況。從表1中可見較低濃度SNP(≤0.50 mmol·L-1)可顯著促進桔梗幼苗生長，尤其當(dāng)SNP濃度為0.10 mmol·L-1時，促生長作用最為明顯，其苗長和根長為對照組(CK)兩倍以上。

表1 不同濃度的SNP對桔梗幼苗生長性狀的影響(7 d)

2.2 不同濃度SNP對桔梗幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1 不同濃度SNP誘導(dǎo)下Pro的含量 Pro是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，同時也是植物眾多可溶性物質(zhì)中最常見和有效的[11]。除參與滲透調(diào)節(jié)外，Pro還發(fā)揮分子伴侶的作用，可以與細(xì)胞中生物大分子結(jié)合以穩(wěn)定蛋白分子構(gòu)象，同時還可以緩沖胞質(zhì)的pH，維持細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)[12]。圖1所示，不同濃度SNP誘導(dǎo)下幼苗中Pro含量隨濃度增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。當(dāng)SNP濃度為0.50 mmol·L-1時，幼苗中Pro的含量最高，比對照組(CK)增加了3.99倍；當(dāng)SNP濃度為1.00 mmol·L-1時，游離Pro的含量則開始降低。

注：不同小寫字母表示各處理樣品中Pro含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖1 不同濃度SNP對桔梗幼苗中Pro含量的影響(n=3)

2.2.2 不同濃度SNP誘導(dǎo)下MDA含量 MDA植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量多少可以反映植物受到逆境傷害的程度[11]。圖2所示，在低濃度SNP誘導(dǎo)下，隨誘導(dǎo)濃度增加，幼苗中MDA含量逐漸降低；當(dāng)SNP濃度增加到0.10 mmol·L-1時，MDA含量降至最低，為對照組(CK)的23%；隨著SNP濃度繼續(xù)增加，MDA含量則開始增加；當(dāng)SNP濃度增加到1.00 mmol·L-1時，MDA含量增加至空白對照組的1.54倍。

注：不同小寫字母表示各處理樣品中MDA含量差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖2 不同濃度的SNP對桔梗幼苗中MDA含量的影響(n=3)

2.2.3 不同濃度SNP誘導(dǎo)下抗氧化酶活性 SOD、POD、CAT為植物體內(nèi)重要的保護酶，維持植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的代謝平衡。當(dāng)植物受到逆境脅迫時，活性氧等有害物質(zhì)會大量產(chǎn)生并不斷積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，造成細(xì)胞通透性增強，細(xì)胞內(nèi)含物的滲出。植物自身的保護酶系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)酶活性而增強細(xì)胞內(nèi)活性氧清除能力，減少由于活性氧而對細(xì)胞造成的損傷，保護細(xì)胞膜的正常功能[13-14]。

2.2.3.1 SOD活性 如圖3所示，SNP對SOD活性的影響表現(xiàn)為低濃度促進，高濃度抑制。隨著SNP溶液濃度的增加，SOD活性不斷增加。當(dāng)SNP溶液濃度增加至0.10 mmol·L-1時，SOD的活性最大，為對照組(CK)的4.34倍，當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增加，則SOD活性迅速降低。

2.2.3.2 POD活性 如圖4所示，SNP對幼苗中POD活性的影響表現(xiàn)趨勢同SOD。隨著SNP濃度的增加，POD活性不斷增加，當(dāng)SNP溶液濃度增加至0.10 mmol·L-1時，幼苗中POD的活性增加至空白對照組(CK)的5.05倍；繼續(xù)增加SNP濃度，POD活性迅速下降。

注：不同小寫字母表示各處理樣品中SOD活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖3 不同濃度的SNP對桔梗幼苗中SOD活性的影響(n=3)

注：不同小寫字母表示各處理樣品中POD活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖4 不同濃度的SNP對桔梗幼苗中POD活性的影響(n=3)

2.2.3.3 CAT活性 圖5所示，SNP對CAT活性的影響也表現(xiàn)為低濃度促進、高濃度抑制的規(guī)律。當(dāng)SNP溶液濃度增加至0.10 mmol·L-1時CAT的活性增加至空白對照組(CK)的2.86倍，當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增加至0.50 mmol·L-1時，CAT活性迅速下降。

注：不同小寫字母表示各處理樣品中CAT活性差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖5 不同濃度的SNP對桔梗幼苗中CAT活性的影響(n=3)

2.3 不同濃度SNP對桔梗幼苗總皂苷含量的影響

桔?？傇碥諡榻酃Ｖ参锏闹饕紊x產(chǎn)物，也是其起治療作用的主要藥效成分。圖6所示，隨SNP濃度的逐漸增加，桔梗幼苗(含胚軸的根部)總皂苷含量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢。當(dāng)SNP濃度為0.50 mmol·L-1時，皂苷含量最高，為對照組(CK)的1.84倍。當(dāng)SNP濃度為1.00 mmol·L-1時，桔梗總皂苷的含量迅速降低。

注：不同小寫字母表示各處理樣品中桔?？傇碥蘸坎町惥哂薪y(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。圖6 不同濃度的SNP對桔梗幼苗中總皂苷含量的影響(n=3)

3 討論

3.1 NO對桔梗幼苗生長的促進作用

王金祥等[15]在擬南芥的研究中發(fā)現(xiàn)，施加外源性NO可以促進插穗生根和根的生長，推測適量NO有促進植物無性繁殖和營養(yǎng)器官建成的作用。尹丹丹等[16]發(fā)現(xiàn)適量的NO處理下的黃長筒石蒜的平均子球莖數(shù)、平均根數(shù)明顯增加；本實驗中低濃度SNP顯著促進了桔梗幼苗生長，無論幼苗高度還是根系長度均與對照組(CK)有了明顯的提高，但過高濃度SNP誘導(dǎo)下，促生長作用明顯減弱，而且出現(xiàn)不同程度的脅迫傷害現(xiàn)象。這說明NO促桔梗幼苗生長具有濃度劑量效應(yīng)，即低濃度促進、高濃度抑制，這與潘龍等[17]對紫花苜蓿的研究結(jié)果相似。

Pro是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。本實驗中，外源性NO可以顯著增加桔梗幼苗中Pro含量，這說明在正常條件下生長的桔梗幼苗仍然可以通過施加適量的外源性NO增加Pro含量，以穩(wěn)定植物體內(nèi)的生物大分子，保護膜與酶的結(jié)構(gòu)，促進和改善生長。

SOD、POD和CAT為植物體內(nèi)重要的保護酶，而MDA則是反映植物受逆境傷害程度的重要指標(biāo)。本實驗中，當(dāng)SNP濃度在0.03～0.10 mmol·L-1時保護酶SOD、POD和CAT的活性顯著升高，而MDA含量則呈現(xiàn)降低的趨勢。這說明SNP在較低濃度下，通過激活保護酶的活性，可以有效地清除植物體產(chǎn)生的活性氧自由基。從植物生長性狀表現(xiàn)可以看出這一濃度范圍內(nèi)植物生長良好，且隨SNP濃度增加植物根和莖長度均呈增加趨勢，這說明SNP通過激活植物體內(nèi)保護酶活性有效清除了植物體內(nèi)活性氧，防止自由基對植物體產(chǎn)生的傷害，從而促進了植物的生長發(fā)育；而當(dāng)SNP濃度增加到1.00 mmol·L-1時，幼苗中保護酶活性降低，活性氧平衡被打破，導(dǎo)致MDA含量顯著增加，植物生長出現(xiàn)抑制。

3.2 NO對桔梗幼苗總皂苷誘導(dǎo)作用

桔梗皂苷類成分是桔梗重要的次生代謝產(chǎn)物。一般認(rèn)為次生代謝產(chǎn)物是植物在進化過程中對不斷變化的環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。一些植物通過次生代謝應(yīng)對外界環(huán)境刺激，例如有研究發(fā)現(xiàn)植物在鹽堿、水分、溫度等環(huán)境刺激下，次生代謝產(chǎn)物在其中發(fā)揮重要作用[18]。從本實驗可以得出，一定濃度的SNP溶液能夠促進桔梗幼苗(含胚軸的根部)皂苷類成分的合成，當(dāng)SNP濃度是0.50 mmol·L-1時，桔梗總皂苷含量是空白對照組(CK)的1.84倍，但當(dāng)濃度繼續(xù)增加至1.00 mmol·L-1時，總皂苷含量有所下降。有研究表明，過量的NO能破壞植物的光合作用和電子鏈傳遞，造成DNA損傷和細(xì)胞死亡，抑制植物的生長發(fā)育，從而減少有效成分的合成[19]?？傮w上，SNP對桔?？傇碥盏挠绊懕憩F(xiàn)在低濃度促進，高濃度抑制。

4 結(jié)論

較低濃度的SNP對桔梗幼苗生長有促進作用，0.50 mmol·L-1的SNP對桔梗幼苗(含胚軸的根部)中總皂苷誘導(dǎo)效果最強。